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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物双酶切遇到问题，求救！！！
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物双酶切遇到问题，求救！！！

各位虫友们
我在做完PCR之后检测得到目的条带，经过切胶回收后检测条带很亮，之后用BamH1和Xho1进行双酶切，发现什么都没有了，条带貌似是没有跑过，什么都没有哇。
为了检验问题，我将空pET28a载体分别用BamH1和Xho1进行单酶切，都能切动。
我用的是PRIME STAR PREMIX进行的PCR。
酶切体系是：
总：30μl
ddH2O：11
10*K：3
片段：15
BamH1/Xho1：0.5/0.5
我使用的酶切条件是，37℃1.5h。
请问各位虫友，这是怎么回事？是PCR片段的问题吗？

[ Last edited by 转基因猴子 on 2013-3-15 at 15:25 ]
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我还年轻，我要上路！
1楼 2013-03-15 15:23:54
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cfr1990

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
转基因猴子: 金币+3 2013-03-15 21:18:30
跑胶时间控制在20分钟试试看
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2楼2013-03-15 16:27:28
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etralf

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
转基因猴子: 金币+3 2013-03-15 21:18:33
PCR后目的条带用taq加A，然后再练到t载体上，这样再试试，既方便测序，有方便了以后操作
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3楼2013-03-15 19:33:30
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转基因猴子

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cfr1990 at 2013-03-15 16:27:28
跑胶时间控制在20分钟试试看

跑胶我用90V25MIN
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我还年轻，我要上路！
4楼2013-03-15 19:58:49
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
转基因猴子: 金币+14, ★★★★★最佳答案, 谢谢西瓜，我换个试剂盒试试 2013-03-15 21:18:22
gyesang: 金币+2, 欢迎老版主经常回来为虫子排忧解难！ 2013-03-16 00:35:26
最近我也碰到了类似的情况，胶回收的产物酶切之后什么都没有了。逐一检查了内切酶、内切酶buffer、水，各种纠结，最后发现是胶回收产物的问题：只加水，在37度下放一两个小时就会降解，如果加了内切酶的buffer，降解得更快。我估计是污染了DNA酶，毕竟DNA酶在内切酶buffer中的活性比在纯水中更高，这也能解释为什么加了buffer降解得更快。
当时着急用，用PCR产物纯化试剂盒再次纯化一次，虽然剩下的东西少得可怜，好歹酶切正常了。
后来问了实验室其他人，他们最近做胶回收的得率也很低，估计是那个试剂盒污染了，后面换了个新的试剂盒就没问题了。
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5楼2013-03-15 21:07:01
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linhehu

铜虫 (小有名气)
看不懂你的问题呢
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在知识的海洋里裸泳
6楼2013-06-11 19:28:34
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西瓜 at 2013-03-15 21:07:01
最近我也碰到了类似的情况，胶回收的产物酶切之后什么都没有了。逐一检查了内切酶、内切酶buffer、水，各种纠结，最后发现是胶回收产物的问题：只加水，在37度下放一两个小时就会降解，如果加了内切酶的buffer，降解 ...

是菌液pcr之后胶回收吗？不是菌液提质粒，然后进行酶切？
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踏实
7楼2014-07-15 17:29:58
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匿名

用户注销 (正式写手)

小虫
本帖仅楼主可见
赞一下
8楼2015-05-22 23:12:24
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