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转基因猴子

木虫 (正式写手)

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[求助] PCR产物双酶切遇到问题，求救！！！

各位虫友们
我在做完PCR之后检测得到目的条带，经过切胶回收后检测条带很亮，之后用BamH1和Xho1进行双酶切，发现什么都没有了，条带貌似是没有跑过，什么都没有哇。
为了检验问题，我将空pET28a载体分别用BamH1和Xho1进行单酶切，都能切动。
我用的是PRIME STAR PREMIX进行的PCR。
酶切体系是：
总：30μl
ddH2O：11
10*K：3
片段：15
BamH1/Xho1：0.5/0.5
我使用的酶切条件是，37℃1.5h。
请问各位虫友，这是怎么回事？是PCR片段的问题吗？

[ Last edited by 转基因猴子 on 2013-3-15 at 15:25 ]

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我还年轻，我要上路！

1楼 2013-03-15 15:23:54

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西瓜

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 欢迎老版主经常回来为虫子排忧解难！ 2013-03-16 00:35:26

最近我也碰到了类似的情况，胶回收的产物酶切之后什么都没有了。逐一检查了内切酶、内切酶buffer、水，各种纠结，最后发现是胶回收产物的问题：只加水，在37度下放一两个小时就会降解，如果加了内切酶的buffer，降解得更快。我估计是污染了DNA酶，毕竟DNA酶在内切酶buffer中的活性比在纯水中更高，这也能解释为什么加了buffer降解得更快。
当时着急用，用PCR产物纯化试剂盒再次纯化一次，虽然剩下的东西少得可怜，好歹酶切正常了。
后来问了实验室其他人，他们最近做胶回收的得率也很低，估计是那个试剂盒污染了，后面换了个新的试剂盒就没问题了。