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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。

我要做一个细菌完整毒力基因的原核表达，基因全长6087bp，连在PET32a上，测序都正确，且表达为包涵体形式。用普通的镍柱纯化，有杂带也就算了，我纯化下来的目的蛋白仅有一条细细的线。。。根本不能进行后续的试验。
     参考其他大家的纯化方法多挂了好几次柱子，咪唑浓度梯度洗脱，效果都不佳，希望大家帮帮忙。。极度崩溃中。。。
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1楼2013-03-11 20:41:29
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+1 2013-03-12 10:20:52
你的表达量高不高，如果表达量不高的话就多搜集点沉淀，溶解后多取一点上柱，只要不超过载量就行，循环反复几次试试，只有挂柱上的蛋白多，你洗下来的量才多1
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2楼2013-03-12 09:00:03
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srwangws

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用包涵体纯化试一下
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3楼2013-03-12 09:15:29
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-12 09:00:03
你的表达量高不高，如果表达量不高的话就多搜集点沉淀，溶解后多取一点上柱，只要不超过载量就行，循环反复几次试试，只有挂柱上的蛋白多，你洗下来的量才多1

表达量不是很高，我摇了1L菌。我用的是康为世纪的包涵体纯化试剂盒，在包涵体溶解后，要过滤膜的过程中，我的很快就虑好了。。就是说明溶解的确实不多，但是都没有挂上，全在流穿液里了。
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4楼2013-03-12 09:32:48
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
崔t-o-p: 金币+1 2013-03-12 10:20:35
引用回帖:
4楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-03-12 09:32:48
表达量不是很高，我摇了1L菌。我用的是康为世纪的包涵体纯化试剂盒，在包涵体溶解后，要过滤膜的过程中，我的很快就虑好了。。就是说明溶解的确实不多，但是都没有挂上，全在流穿液里了。...

你用的比较高级啊，我当时还是自己做的柱子！如果溶解的蛋白不多的话可以试试超滤，浓缩一下，跑个蛋白胶看看，再上柱，不管怎么说就是要想方设法的把目的蛋白尽可能多的挂到柱子上，只有这样才能收的多。
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5楼2013-03-12 09:51:01
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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崔t-o-p: 金币+1, ★有帮助 2013-03-12 10:36:28
我不知道你的目的是啥，如果做的与这个蛋白的功能相关建议立马换载体重新构建，在native下纯化。因为就包涵体而言，纯化时很简单的，复性是相对较难的，你现在纯化出来的量就这么少，复性加复性缓冲液，摸索条件等等，你会非常吃力的。
如果你这是想做他的抗体之类的，对他的三维要求弱点，你可以：1.换载体，诱导高表达的包涵体，你载体构建肯定过关了，对你很容易，咨询你的同学老师找个能让目的蛋白表达量高的载体先行构建，以防发现不换载体会严重影响你的后续实验。2.先行裂解细菌，除掉上清，变性溶解包涵体时所加变性液体积降低以增大目的蛋白在溶液中的浓度。3.根据试剂盒上问题提醒或直接咨询他们技术部。4.将洗脱液体积降低，堵住柱子流出端，让洗脱液与胶混匀一段时间充分洗脱后收集。4.洗脱时是有洗脱峰的，用50ul或100ul洗脱/次，然后跑胶查看洗脱峰在哪里（也可以用考马斯亮蓝G-250快速检测），后面大量纯化时只收集洗脱峰处液体，提醒：千万不要让胶干掉！
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学习，进步
6楼2013-03-12 10:00:37
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 生物小通 at 2013-03-12 10:00:37
我不知道你的目的是啥，如果做的与这个蛋白的功能相关建议立马换载体重新构建，在native下纯化。因为就包涵体而言，纯化时很简单的，复性是相对较难的，你现在纯化出来的量就这么少，复性加复性缓冲液，摸索条件等等 ...

构建载体的时候，话说我也是很费劲； 我就是按照你说的方法进行的，先加细菌裂解液等超声破碎，离心弃上清，溶解包涵体；
   我是将流穿液多挂了几次柱子，挂上后堵住，多作用了一会。洗脱液没有停留时间长。我们没有检测仪所以查看洗脱峰的话，比较费劲，要等到跑胶才能看结果。非常感谢！！
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7楼2013-03-12 10:43:07
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
大家来帮帮忙。。。。
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8楼2013-03-12 17:03:57
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-03-12 10:43:07
构建载体的时候，话说我也是很费劲； 我就是按照你说的方法进行的，先加细菌裂解液等超声破碎，离心弃上清，溶解包涵体；
   我是将流穿液多挂了几次柱子，挂上后堵住，多作用了一会。洗脱液没有停留时间长。我们 ...

可以用考马斯亮蓝G-250，取几ul点进去看看颜色变化，另外就是温度也很重要，20-25度最佳，你的细菌裂解液是否含有EDTA，你最好取点胶跑胶看看到底是没有结合上还是漂洗没了等等，祝你成功！
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学习，进步
9楼2013-03-12 17:33:21
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