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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 2210186
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性别: MM
专业: 兽医传染病学

[求助] 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。

我要做一个细菌完整毒力基因的原核表达，基因全长6087bp，连在PET32a上，测序都正确，且表达为包涵体形式。用普通的镍柱纯化，有杂带也就算了，我纯化下来的目的蛋白仅有一条细细的线。。。根本不能进行后续的试验。
参考其他大家的纯化方法多挂了好几次柱子，咪唑浓度梯度洗脱，效果都不佳，希望大家帮帮忙。。极度崩溃中。。。

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1楼2013-03-11 20:41:29

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生物小通

木虫 (正式写手)

应助: 29 (小学生)
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专业: 肿瘤复发与转移

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+1, ★有帮助 2013-03-12 10:36:28

我不知道你的目的是啥，如果做的与这个蛋白的功能相关建议立马换载体重新构建，在native下纯化。因为就包涵体而言，纯化时很简单的，复性是相对较难的，你现在纯化出来的量就这么少，复性加复性缓冲液，摸索条件等等，你会非常吃力的。
如果你这是想做他的抗体之类的，对他的三维要求弱点，你可以：1.换载体，诱导高表达的包涵体，你载体构建肯定过关了，对你很容易，咨询你的同学老师找个能让目的蛋白表达量高的载体先行构建，以防发现不换载体会严重影响你的后续实验。2.先行裂解细菌，除掉上清，变性溶解包涵体时所加变性液体积降低以增大目的蛋白在溶液中的浓度。3.根据试剂盒上问题提醒或直接咨询他们技术部。4.将洗脱液体积降低，堵住柱子流出端，让洗脱液与胶混匀一段时间充分洗脱后收集。4.洗脱时是有洗脱峰的，用50ul或100ul洗脱/次，然后跑胶查看洗脱峰在哪里（也可以用考马斯亮蓝G-250快速检测），后面大量纯化时只收集洗脱峰处液体，提醒：千万不要让胶干掉！