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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助!220KDa蛋白纯化。。。

我要做一个细菌完整毒力基因的原核表达,基因全长6087bp,连在PET32a上,测序都正确,且表达为包涵体形式。用普通的镍柱纯化,有杂带也就算了,我纯化下来的目的蛋白仅有一条细细的线。。。根本不能进行后续的试验。
     参考其他大家的纯化方法多挂了好几次柱子,咪唑浓度梯度洗脱,效果都不佳,希望大家帮帮忙。。极度崩溃中。。。
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


崔t-o-p: 金币+1 2013-03-12 10:20:35
引用回帖:
4楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-03-12 09:32:48
表达量不是很高,我摇了1L菌。我用的是康为世纪的包涵体纯化试剂盒,在包涵体溶解后,要过滤膜的过程中,我的很快就虑好了。。就是说明溶解的确实不多,但是都没有挂上,全在流穿液里了。...

你用的比较高级啊,我当时还是自己做的柱子!如果溶解的蛋白不多的话可以试试超滤,浓缩一下,跑个蛋白胶看看,再上柱,不管怎么说就是要想方设法的把目的蛋白尽可能多的挂到柱子上,只有这样才能收的多。
5楼2013-03-12 09:51:01
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+1 2013-03-12 10:20:52
你的表达量高不高,如果表达量不高的话就多搜集点沉淀,溶解后多取一点上柱,只要不超过载量就行,循环反复几次试试,只有挂柱上的蛋白多,你洗下来的量才多1
2楼2013-03-12 09:00:03
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srwangws

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以用包涵体纯化试一下
3楼2013-03-12 09:15:29
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-12 09:00:03
你的表达量高不高,如果表达量不高的话就多搜集点沉淀,溶解后多取一点上柱,只要不超过载量就行,循环反复几次试试,只有挂柱上的蛋白多,你洗下来的量才多1

表达量不是很高,我摇了1L菌。我用的是康为世纪的包涵体纯化试剂盒,在包涵体溶解后,要过滤膜的过程中,我的很快就虑好了。。就是说明溶解的确实不多,但是都没有挂上,全在流穿液里了。
4楼2013-03-12 09:32:48
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