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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

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[求助] 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。

我要做一个细菌完整毒力基因的原核表达，基因全长6087bp，连在PET32a上，测序都正确，且表达为包涵体形式。用普通的镍柱纯化，有杂带也就算了，我纯化下来的目的蛋白仅有一条细细的线。。。根本不能进行后续的试验。
参考其他大家的纯化方法多挂了好几次柱子，咪唑浓度梯度洗脱，效果都不佳，希望大家帮帮忙。。极度崩溃中。。。

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1楼 2013-03-11 20:41:29

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生物小通

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

7楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-03-12 10:43:07
构建载体的时候，话说我也是很费劲；我就是按照你说的方法进行的，先加细菌裂解液等超声破碎，离心弃上清，溶解包涵体；
我是将流穿液多挂了几次柱子，挂上后堵住，多作用了一会。洗脱液没有停留时间长。我们 ...

可以用考马斯亮蓝G-250，取几ul点进去看看颜色变化，另外就是温度也很重要，20-25度最佳，你的细菌裂解液是否含有EDTA，你最好取点胶跑胶看看到底是没有结合上还是漂洗没了等等，祝你成功！