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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助！220KDa蛋白纯化。。。

我要做一个细菌完整毒力基因的原核表达，基因全长6087bp，连在PET32a上，测序都正确，且表达为包涵体形式。用普通的镍柱纯化，有杂带也就算了，我纯化下来的目的蛋白仅有一条细细的线。。。根本不能进行后续的试验。
     参考其他大家的纯化方法多挂了好几次柱子，咪唑浓度梯度洗脱，效果都不佳，希望大家帮帮忙。。极度崩溃中。。。
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1楼 2013-03-11 20:41:29
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-03-12 10:43:07
构建载体的时候，话说我也是很费劲； 我就是按照你说的方法进行的，先加细菌裂解液等超声破碎，离心弃上清，溶解包涵体；
   我是将流穿液多挂了几次柱子，挂上后堵住，多作用了一会。洗脱液没有停留时间长。我们 ...

可以用考马斯亮蓝G-250，取几ul点进去看看颜色变化，另外就是温度也很重要，20-25度最佳，你的细菌裂解液是否含有EDTA，你最好取点胶跑胶看看到底是没有结合上还是漂洗没了等等，祝你成功！
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学习，进步
9楼2013-03-12 17:33:21
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+1 2013-03-12 10:20:52
你的表达量高不高，如果表达量不高的话就多搜集点沉淀，溶解后多取一点上柱，只要不超过载量就行，循环反复几次试试，只有挂柱上的蛋白多，你洗下来的量才多1
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2楼2013-03-12 09:00:03
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srwangws

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用包涵体纯化试一下
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3楼2013-03-12 09:15:29
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-12 09:00:03
你的表达量高不高，如果表达量不高的话就多搜集点沉淀，溶解后多取一点上柱，只要不超过载量就行，循环反复几次试试，只有挂柱上的蛋白多，你洗下来的量才多1

表达量不是很高，我摇了1L菌。我用的是康为世纪的包涵体纯化试剂盒，在包涵体溶解后，要过滤膜的过程中，我的很快就虑好了。。就是说明溶解的确实不多，但是都没有挂上，全在流穿液里了。
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4楼2013-03-12 09:32:48
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