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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 电泳图为什么有拖尾
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)

[求助] 电泳图为什么有拖尾

对目的片段切胶回收进行连接转化，挑单克隆，摇菌后用M13通用引物进行菌液PCR，退火温度设为55度，目的条带为1kb左右。电泳后发现有目的条带的拖尾非常严重，这是什么原因造成的？我电泳时的电压为90v，胶浓度约为1.5%。菌液在4度存放了3-4天，会有影响吗？麻烦高手帮忙分析一下。

胶图.jpg
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1楼 2012-12-25 19:22:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liuyun076826

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 身未动 at 2012-12-25 21:29:13
（1）菌液浓度高，导致模板浓度高了，下次你稀释一下试试。
（2）退火温度低，把退火温度升个5度试试。

好的，谢谢您的建议
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14楼2012-12-26 08:43:20
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普通回帖

moshangchenx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, ★有帮助 2012-12-26 14:43:14
个人感觉胶没制好，好的胶MARKER是不会有拖尾的，建议看一下marker说明书，是不是2%更合适
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科研无止境，我心成蹉跎
2楼2012-12-25 20:20:09
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mguo15

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, ★有帮助 2012-12-26 14:42:21
菌不会有问题！你是否模板DNA用的太多了，建议减少菌液试试。另外PCR产物上样也酌情减少。
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3楼2012-12-25 20:32:24
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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liuyun076826: 金币+1, ★有帮助 2012-12-26 14:42:29
可能原因：
1、退火温度偏低，导致非特异扩增增多；
2、模板量太高；

1kb的片段，1.0或1.2的胶就可以啦。上1kb的，我都用0.8.
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
4楼2012-12-25 20:56:56
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, ★有帮助 2012-12-26 14:43:02
本帖仅楼主可见
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5楼2012-12-25 21:22:49
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身未动

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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liuyun076826: 金币+1, ★有帮助 2012-12-26 14:42:38
（1）菌液浓度高，导致模板浓度高了，下次你稀释一下试试。
（2）退火温度低，把退火温度升个5度试试。
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天道酬勤
6楼2012-12-25 21:29:13
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是你的pcr扩增 特异性太差了杂的太多   还有胶没必要太浓
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7楼2012-12-25 22:52:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用菌做PCR模板本身就脏，DNA的量也不容易控制，一般都是太多。PCR产物有拖尾的现象属于正常。反正做这类PCR的目的只是筛选阳性克隆，有目的条带就可以了，对图片的质量没那么严格吧。
至于marker也有些问题可能是胶做得不是特别好。
M13有两对通用引物，你用的是哪一对？有一对的退火温度比较低，大概就是用56度P。
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8楼2012-12-26 01:21:49
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-26 01:21:49
直接用菌做PCR模板本身就脏，DNA的量也不容易控制，一般都是太多。PCR产物有拖尾的现象属于正常。反正做这类PCR的目的只是筛选阳性克隆，有目的条带就可以了，对图片的质量没那么严格吧。
至于marker也有些问题可能 ...

谢谢回复。我用的引物是M13F(-47), M13R(-48). 这对引物正反向Tm值差很多，一个是68度左右，一个是57度左右，所以我用的55度退火。
确实是图片质量要求不严格，但是这样的结果如果是PCR体系或者电泳的影响问题倒也不大，如果是菌液本身的问题的话，会不会影响测序呀？我计划把菌液送出去测序的~
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9楼2012-12-26 08:38:24
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by moshangchenx at 2012-12-25 20:20:09
个人感觉胶没制好，好的胶MARKER是不会有拖尾的，建议看一下marker说明书，是不是2%更合适

谢谢，我做胶没有严格称量控制，就是大约加的，做出来的胶挺硬的。
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10楼2012-12-26 08:40:33
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