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liuyun076826

金虫 (初入文坛)

[求助] 电泳图为什么有拖尾

对目的片段切胶回收进行连接转化,挑单克隆,摇菌后用M13通用引物进行菌液PCR,退火温度设为55度,目的条带为1kb左右。电泳后发现有目的条带的拖尾非常严重,这是什么原因造成的?我电泳时的电压为90v,胶浓度约为1.5%。菌液在4度存放了3-4天,会有影响吗?麻烦高手帮忙分析一下。

胶图.jpg
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 身未动 at 2012-12-25 21:29:13
(1)菌液浓度高,导致模板浓度高了,下次你稀释一下试试。
(2)退火温度低,把退火温度升个5度试试。

好的,谢谢您的建议
14楼2012-12-26 08:43:20
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普通回帖

moshangchenx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, 有帮助 2012-12-26 14:43:14
个人感觉胶没制好,好的胶MARKER是不会有拖尾的,建议看一下marker说明书,是不是2%更合适
科研无止境,我心成蹉跎
2楼2012-12-25 20:20:09
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mguo15

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, 有帮助 2012-12-26 14:42:21
菌不会有问题!你是否模板DNA用的太多了,建议减少菌液试试。另外PCR产物上样也酌情减少。
3楼2012-12-25 20:32:24
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, 有帮助 2012-12-26 14:42:29
可能原因:
1、退火温度偏低,导致非特异扩增增多;
2、模板量太高;

1kb的片段,1.0或1.2的胶就可以啦。上1kb的,我都用0.8.
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
4楼2012-12-25 20:56:56
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匿名

用户注销 (正式写手)


感谢参与,应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, 有帮助 2012-12-26 14:43:02
本帖仅楼主可见
5楼2012-12-25 21:22:49
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身未动

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuyun076826: 金币+1, 有帮助 2012-12-26 14:42:38
(1)菌液浓度高,导致模板浓度高了,下次你稀释一下试试。
(2)退火温度低,把退火温度升个5度试试。
天道酬勤
6楼2012-12-25 21:29:13
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是你的pcr扩增 特异性太差了杂的太多   还有胶没必要太浓
7楼2012-12-25 22:52:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接用菌做PCR模板本身就脏,DNA的量也不容易控制,一般都是太多。PCR产物有拖尾的现象属于正常。反正做这类PCR的目的只是筛选阳性克隆,有目的条带就可以了,对图片的质量没那么严格吧。
至于marker也有些问题可能是胶做得不是特别好。
M13有两对通用引物,你用的是哪一对?有一对的退火温度比较低,大概就是用56度P。
8楼2012-12-26 01:21:49
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-26 01:21:49
直接用菌做PCR模板本身就脏,DNA的量也不容易控制,一般都是太多。PCR产物有拖尾的现象属于正常。反正做这类PCR的目的只是筛选阳性克隆,有目的条带就可以了,对图片的质量没那么严格吧。
至于marker也有些问题可能 ...

谢谢回复。我用的引物是M13F(-47), M13R(-48). 这对引物正反向Tm值差很多,一个是68度左右,一个是57度左右,所以我用的55度退火。
确实是图片质量要求不严格,但是这样的结果如果是PCR体系或者电泳的影响问题倒也不大,如果是菌液本身的问题的话,会不会影响测序呀?我计划把菌液送出去测序的~
9楼2012-12-26 08:38:24
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liuyun076826

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by moshangchenx at 2012-12-25 20:20:09
个人感觉胶没制好,好的胶MARKER是不会有拖尾的,建议看一下marker说明书,是不是2%更合适

谢谢,我做胶没有严格称量控制,就是大约加的,做出来的胶挺硬的。
10楼2012-12-26 08:40:33
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