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huangyan0517

金虫 (小有名气)

[求助] sds电泳拖尾,求原因

如图,条带有些拖尾,跑的是溶菌酶单体、二聚体、多聚体混合液,浓缩胶5%,分离胶15%,2倍上样buffer混合样品成一倍,每孔15ul,问题可能出在哪?分离胶tris测ph6.8,和要求的6.8基本一致,分离胶tris8.9,和要求8.8有点差别,问题大吗?电泳设置为80v,20min,120v,50min。搞不明白哪里出问题,另外灌完分离胶,我都是用1000ul的枪,加满封闭,管浓缩胶时水也有点残留,另外别人说加aps和temed要抽空气,难道真是这个原因?求高人指点

九月浓缩.jpg
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时间在哪里,成就就在哪里
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-08 14:07:31
分离胶的Tris的pH是挺重要的,不准可能造成条带不sharp。灌好分离胶封闭不必加满,只要有大约0.5-1cm就行了,加的时候要缓慢均匀。做浓缩胶的时候尽量把水弄干,不过有一点点应该问题不大的。抽空气是为了减少溶液中的氧气含量,氧气会抑制胶的聚合。不抽也没多少关系,很多人只是稍稍多加一点点APS和TEMED。只要你的胶不是凝得特别慢就没必要抽气。不知道你的上样量是多少,有时候样品没处理好也会造成拖尾。
2楼2012-10-08 13:51:41
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-08 13:51:41
分离胶的Tris的pH是挺重要的,不准可能造成条带不sharp。灌好分离胶封闭不必加满,只要有大约0.5-1cm就行了,加的时候要缓慢均匀。做浓缩胶的时候尽量把水弄干,不过有一点点应该问题不大的。抽空气是为了减少溶液中 ...

上样每孔15ul,ph我当时调的是8.8,可能时间长了,发生变化了
时间在哪里,成就就在哪里
3楼2012-10-08 14:32:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by huangyan0517 at 2012-10-08 14:32:11
上样每孔15ul,ph我当时调的是8.8,可能时间长了,发生变化了...

我是想问一下你上了多少ug的蛋白,感觉是不是稍微有点过量了。你做的是考染还是荧光染色?还有就是样品里的离子强度过高的话也会造成胶跑不好。
4楼2012-10-08 14:39:37
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你左边的两个是什么?给我的感觉是你样品量大了,或者是上胶短了导致它们不在一个起跑线上开始分离
谢谢你给我信心与力量,我会努力!
5楼2012-10-08 18:12:13
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