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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段与载体连接后无法检测出
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

[求助] 目的片段与载体连接后无法检测出

要做 互补实验，需要的目的片段（2.8kb）用PCR扩增，双酶切后T4连接酶连到载体pCT-Zori 上，转入DH5α中，用Cm+Xgal+IPTG 的平板做蓝白斑筛选，基本上的到的全部是白斑，选取白斑扩大培养后，提取质粒，进行PCR验证，但是没有目的片段的出现，双酶切也没有目的片段（条带只有一条，载体的）。
实验重复了好久了，结果都是这样的

求各位大牛帮忙分析下，谢谢啦！
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啊木
1楼 2012-08-10 17:21:44
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2012-08-10 20:18:28
1.Xgal,IPTG是否过期所以没有蓝斑？建议楼主转个空质粒作对照看看
2.如果有通用引物，建议用通用引物对转化后质粒进行PCR，以确定是否连入其他外源片段
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2楼2012-08-10 18:07:25
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 18:07:25
1.Xgal,IPTG是否过期所以没有蓝斑？建议楼主转个空质粒作对照看看
2.如果有通用引物，建议用通用引物对转化后质粒进行PCR，以确定是否连入其他外源片段

Xgal,IPTG应该没有过期，同学刚做过，他的都是蓝斑；
另外你说的通用引物是指在载体的多克隆位点附近设计一对引物用来扩外源片段吗？
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啊木
3楼2012-08-10 18:25:34
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极热心应助 2012-08-13 14:58:27
楼主，最后提取到质粒没有？
我的意思是你提取质粒后跑胶了没有，可以取1微升跑个胶看下。
如果质粒是提出来了的，可以用单、双酶切同时鉴定.
单酶切可以知道酶切后分子量的大小（假设为8000bp）,假设你的质粒是6000bp，那么你的连接可能是成功的。
双酶切，可以更准确的知道你的连接片段的长度，但是有时候双酶切两个酶的酶切温度并不一致会造成酶切不充分或者其中之一的酶没工作。
个人觉得用单双酶切进行相互印证是比较可靠的。
此外，楼主在转化的时候可以做2个对照，1.原来做过的成功的做一个阳性对照，2，阴性对照，可以用空载体。
最后，你的片段是否太大没有连上，或者连接时间或温度等不适合？此外，请再挑取单克隆后做菌落PCR来验证是否克隆时正确的，同时用你的引物（连接片段中可设计特异引物）以及载体的通用引物（或者你自己根据载体设计也可以），同一个单菌落挑取后混匀到10微升水里，分别取1微升出来，用上述2对引物扩增来确定克隆正确与否。
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4楼2012-08-10 21:49:52
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-10 21:49:52
楼主，最后提取到质粒没有？
我的意思是你提取质粒后跑胶了没有，可以取1微升跑个胶看下。
如果质粒是提出来了的，可以用单、双酶切同时鉴定.
单酶切可以知道酶切后分子量的大小（假设为8000bp）,假设你的质粒是 ...

最后提取到质粒了，但是浓度不高
当时是用提取的质粒为模板，用我扩目的片段时的引物做的PCR，没有扩出条带，我基因组DNA做正对照的扩出来了，说明PCR体系什么的没问题，昨天把质粒送去测序了，用载体的通用引物，看到底连接上去的是什么。
酶切是做的单酶切，用空载体做了阴性对照，结果条带的位置是一样的，应该就是目的片段没有连接上去。
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啊木
5楼2012-08-12 09:52:46
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

楼主既然没有连上去还测什么序啊？？
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6楼2012-08-12 19:46:38
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-13 14:58:40
做的比较相似，遇到的问题更麻烦，菌落PCR结果都OK的，测序还是空载的，烦人。
但是学了个方法，可以先看看是否连接上了：在连接后，转化前，把你的连接产物做为模版，用载体的通用引物做PCR，如果有目标条带，那么应该是连接OK了，再做转化的验证；如果没有，可能连接这一步还要优化下。
不知道对楼主有没有启示
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7楼2012-08-12 21:22:58
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-13 14:58:50
楼主，还需要考虑质粒自连的情况，因为你加了连接酶，因此也会有这种情况出现。因此，在做连接时加大一些DNA用量，连接时间长一些或许会好一些，此外，在挑取单菌落时可以多挑点，因为你的连接效率可能太低，来做个菌落PCR验证。
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8楼2012-08-13 08:11:40
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