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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

[求助] 目的片段与载体连接后无法检测出

要做 互补实验,需要的目的片段(2.8kb)用PCR扩增,双酶切后T4连接酶连到载体pCT-Zori 上,转入DH5α中,用Cm+Xgal+IPTG 的平板做蓝白斑筛选,基本上的到的全部是白斑,选取白斑扩大培养后,提取质粒,进行PCR验证,但是没有目的片段的出现,双酶切也没有目的片段(条带只有一条,载体的)。
实验重复了好久了,结果都是这样的

求各位大牛帮忙分析下,谢谢啦!
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啊木
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhqu1234 at 2012-08-10 18:07:25
1.Xgal,IPTG是否过期所以没有蓝斑?建议楼主转个空质粒作对照看看
2.如果有通用引物,建议用通用引物对转化后质粒进行PCR,以确定是否连入其他外源片段

Xgal,IPTG应该没有过期,同学刚做过,他的都是蓝斑;
另外你说的通用引物是指在载体的多克隆位点附近设计一对引物用来扩外源片段吗?
啊木
3楼2012-08-10 18:25:34
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-10 21:49:52
楼主,最后提取到质粒没有?
我的意思是你提取质粒后跑胶了没有,可以取1微升跑个胶看下。
如果质粒是提出来了的,可以用单、双酶切同时鉴定.
单酶切可以知道酶切后分子量的大小(假设为8000bp),假设你的质粒是 ...

最后提取到质粒了,但是浓度不高
当时是用提取的质粒为模板,用我扩目的片段时的引物做的PCR,没有扩出条带,我基因组DNA做正对照的扩出来了,说明PCR体系什么的没问题,昨天把质粒送去测序了,用载体的通用引物,看到底连接上去的是什么。
酶切是做的单酶切,用空载体做了阴性对照,结果条带的位置是一样的,应该就是目的片段没有连接上去。
啊木
5楼2012-08-12 09:52:46
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