| 查看: 7905 | 回复: 54 | ||||
[求助]
构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上 已有1人参与
|
||||
|
连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下： 载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 杂项 |
» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有218人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有2人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 构建植物表达载体pBI121带着GUS有木有影响啊
已经有9人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- 已经带his标签目的蛋白基因如何设计引物啊（目的基因已经接在pET-22b的载体上了）
已经有8人回复
- 关于SiRNA表达载体构建的问题
已经有9人回复
- 目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题
已经有14人回复
- 表达载体的构建
已经有17人回复
- 表达载体构建的相关问题
已经有15人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 【求助/交流】目的基因与pPIC9K连接的问题！
已经有9人回复
- 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
已经有22人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】菌落PCR问题
已经有23人回复
- 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
已经有27人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题
已经有6人回复
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的： 1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做，我们实验室也做过你说的这两个酶的分布双酶切，就是从低盐到高盐的顺序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切体系如下： 50μl的体系里加入SacI 1.2μl，DNA约1μg，其他的Buffer和水，你看着体系补就行了，酶切1.5h；然后再加大体系，扩成150μl的体系，加入BamHI2μl，Buffer和水补足。各自酶在最适的Buffer里切割。补充一下，单酶切一个之后，为了排除对下一个酶的影响，你可以高温使酶失活一下。不做这一步也行的。 2.载体和目的片段都要照着上述的步骤分布双酶切，不知道你切下来的片段大小了，如果切下来的片段大小跟留下来的差不多，建议你割胶回收，如果差别很大，就可以用生工生物的PCR产物纯化试剂盒纯化酶切后的产物。最后得到用于连接的目的片段和载体，用琼脂糖凝胶鉴定一下，条带的亮度，建议加个marker，可以估算一下DNA的分子质量，以便于下一步的连接。 3.连接体系的确定就看连接酶说明书上的就行，目的片段和载体的比例如何确定的呢，看你的目的片段和载体的大小了，如果相差的多，目的片段：载体=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。 4.最后涂板的时候，我的建议是你做上以下几个对照，卡那霉素平板上加你的感受态细胞，这个是鉴定感受态细胞有没有污染的；一个是载体自己连接 的，就是看看双酶切有没有切完全；一个是感受态细胞涂在LB平板上的，看 感受态细胞效率怎么样；这些对照和你的转化涂板同时做，就可以知道问题出在哪里了。 以上就是我的建议，希望对你有帮助。 |
38楼2012-04-20 14:12:19
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2012-02-21 09:46:36
zhiqiang5070
木虫 (正式写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 2711.4
- 散金: 66
- 红花: 1
- 帖子: 459
- 在线: 117小时
- 虫号: 743352
- 注册: 2009-04-08
- 性别: GG
- 专业: 抗肿瘤药物药理
8楼2012-02-21 09:56:28
30楼2012-02-22 19:57:47
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
|
你克隆不成功的现象是什么？ 如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的 如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。 关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间 |
2楼2012-02-20 22:55:32
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★
西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
|
双酶切的在线软件，用户名和密码都是test http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
3楼2012-02-20 22:56:12
4楼2012-02-21 08:58:00
whb21
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 105 (高中生)
- 金币: 9711.3
- 散金: 625
- 红花: 7
- 帖子: 2994
- 在线: 172.4小时
- 虫号: 928584
- 注册: 2009-12-15
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2012-02-21 09:40:59
zhiqiang5070
木虫 (正式写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 2711.4
- 散金: 66
- 红花: 1
- 帖子: 459
- 在线: 117小时
- 虫号: 743352
- 注册: 2009-04-08
- 性别: GG
- 专业: 抗肿瘤药物药理
7楼2012-02-21 09:53:14
9楼2012-02-21 10:29:22
10楼2012-02-21 10:35:28
