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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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cxnde007

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已有1人参与

连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下：
       载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！
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坚强不是我的错
1楼2012-02-20 16:57:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

haoying1986

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的：
1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做，我们实验室也做过你说的这两个酶的分布双酶切，就是从低盐到高盐的顺序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切体系如下：
50μl的体系里加入SacI 1.2μl，DNA约1μg，其他的Buffer和水，你看着体系补就行了，酶切1.5h；然后再加大体系，扩成150μl的体系，加入BamHI2μl，Buffer和水补足。各自酶在最适的Buffer里切割。补充一下，单酶切一个之后，为了排除对下一个酶的影响，你可以高温使酶失活一下。不做这一步也行的。
2.载体和目的片段都要照着上述的步骤分布双酶切，不知道你切下来的片段大小了，如果切下来的片段大小跟留下来的差不多，建议你割胶回收，如果差别很大，就可以用生工生物的PCR产物纯化试剂盒纯化酶切后的产物。最后得到用于连接的目的片段和载体，用琼脂糖凝胶鉴定一下，条带的亮度，建议加个marker，可以估算一下DNA的分子质量，以便于下一步的连接。
3.连接体系的确定就看连接酶说明书上的就行，目的片段和载体的比例如何确定的呢，看你的目的片段和载体的大小了，如果相差的多，目的片段：载体=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。
4.最后涂板的时候，我的建议是你做上以下几个对照，卡那霉素平板上加你的感受态细胞，这个是鉴定感受态细胞有没有污染的；一个是载体自己连接
的，就是看看双酶切有没有切完全；一个是感受态细胞涂在LB平板上的，看
感受态细胞效率怎么样；这些对照和你的转化涂板同时做，就可以知道问题出在哪里了。
以上就是我的建议，希望对你有帮助。
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38楼2012-04-20 14:12:19
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

西瓜(金币+2): 很热心 2012-02-22 18:41:36
我用双酶切软件算了一下你的实验所需的酶量，发现SacI的酶用量应该比BamHI高至少一倍以上。如果你用同样的酶量进行酶切，效果恐怕不太好。
你能确保载体本身处理的很好吗？克隆失败最可能的原因就是载体双酶切不彻底，导致连接反应时载体的自连（载体自连的效率比外源片度插于载体的效率高至少10倍以上）
其实，判断载体处理是否好的一个最可靠的方法就是：设置一个载体的自连接反应，然后转化，看看克隆形成率（与目的连接进行比较），载体处理的好时，目的连接的克隆数较自连的克隆数高3倍以上。
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6楼2012-02-21 09:46:36
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的两个酶间距应该在20bp以上吧，直接双酶切不就行了，双酶切效率高些
4.目的：载体的比例
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无善无恶心之体
8楼2012-02-21 09:56:28
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 幽香清远 at 2012-02-22 18:56:26:
我有遇到和你差不多的问题过，后来解决办法是先用sac1切，后用bamH1切。因为后者的效率很高，可以保证切的完全
至于自连都没长，就无法解释了，抗性没有弄错吧

我是先用BamHI切的，再用SacI切的。抗性没问题，哎，无语啦！！！
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坚强不是我的错
30楼2012-02-22 19:57:47
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普通回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。
关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间
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2楼2012-02-20 22:55:32
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
双酶切的在线软件，用户名和密码都是test
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php
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3楼2012-02-20 22:56:12
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆 ...

感受态已经换过了，应该没有问题。
自连也不长菌，我的目的片段是从pmd18-simple上双酶切得到的，而且载体的双酶切也很彻底，我用酶切回收后的载体片段做转化没有菌落，这是不是说明酶切没有问题呢，我以前没做过这方面，实验室的师兄师姐也都没做过，都要愁死了
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坚强不是我的错
4楼2012-02-21 08:58:00
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人感觉你酶切时间有点长，不知道你是否做了空载的空白对照
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5楼2012-02-21 09:40:59
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 10:08:12
1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的两个酶间距应该在20bp以上吧，直接双酶切不就行了，双酶切效率高些
4.目的：载体的比例
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无善无恶心之体
7楼2012-02-21 09:53:14
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-21 09:46:36:
我用双酶切软件算了一下你的实验所需的酶量，发现SacI的酶用量应该比BamHI高至少一倍以上。如果你用同样的酶量进行酶切，效果恐怕不太好。
你能确保载体本身处理的很好吗？克隆失败最可能的原因就是载体双酶切不 ...

现在的问题是自连都长不出菌来，还有一个问题就是，我最开始转化涂板培养后，不论培养几天都没有菌长出来，后来就是实验组、对照组都在培养两三天才长出菌来，这是为什么呢？有的菌还能在含抗生素的培养基中要起来，但是pcr检测有没有条带？
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坚强不是我的错
9楼2012-02-21 10:29:22
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-21 09:56:28:
1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的 ...

哦，谢谢。感受态没问题，回收产物也测过了，很纯的，回收时也注意了让酒精挥发的问题。不知道卡那浓度一般应该是多少啊？我的卡那工作浓度是600mg/L,这个浓度是不是高呢？转化质粒时长的满满一板，可是自连就一个也没有，纠结中，快崩溃了！
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10楼2012-02-21 10:35:28
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