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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
20楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 18:04:47:
就是载体大片段的自连

你转过载体么  你说会不会是kan抗性基因退变了
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
21楼2012-02-21 19:35:53
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
21楼: Originally posted by fungixx at 2012-02-21 19:35:53:
你转过载体么  你说会不会是kan抗性基因退变了

突变了
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
22楼2012-02-21 19:36:31
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by fungixx at 2012-02-21 19:36:31:
突变了

转化质粒长得满满一板啊
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坚强不是我的错
23楼2012-02-21 20:25:56
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wanglei512

金虫 (正式写手)
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:40:06
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18楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 16:38:21:
不好意思，我写错了，是60mg/L，这个浓度相对也是比较大的吧，我今天把浓度减半又试了一下，不知道结果会怎么样，期待ing

这个浓度不高，50——100都行的。我这两天也遇到这种情况了，我自己做的电转的感受态细胞，怎么也不长，时间长了就是那种针尖状的。但是换了化转的感受态细胞长了。所以我建议你把重点放在感受态细胞上，有的时候放假回去了，回来克隆就不行了。不行就买一批新的感受态试试吧。还有就是看看你载体上的SacI和BamHI酶切位点是不是很接近，或者共用了碱基，这种情况也是连接不上的
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24楼2012-02-22 11:34:16
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wanglei512

金虫 (正式写手)
如果你的pBI121没有修改过的的话，pBI121载体上有两个BamHI的酶切位点，不知道你为啥用这个点
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25楼2012-02-22 11:38:44
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wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-02-22 11:38:44:
如果你的pBI121没有修改过的的话，pBI121载体上有两个BamHI的酶切位点，不知道你为啥用这个点

如果真是这样，那么BamHI这个点是不能用的，
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26楼2012-02-22 12:08:58
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-02-22 11:34:16:
这个浓度不高，50——100都行的。我这两天也遇到这种情况了，我自己做的电转的感受态细胞，怎么也不长，时间长了就是那种针尖状的。但是换了化转的感受态细胞长了。所以我建议你把重点放在感受态细胞上，有的时候 ...

这两个酶切位点之间1800多bp呢，感受态也换新的了
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坚强不是我的错
27楼2012-02-22 15:28:43
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-02-22 11:38:44:
如果你的pBI121没有修改过的的话，pBI121载体上有两个BamHI的酶切位点，不知道你为啥用这个点

我查过了pBI121序列了，就只有一个BamHI位点啊？
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坚强不是我的错
28楼2012-02-22 15:29:56
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幽香清远

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我有遇到和你差不多的问题过，后来解决办法是先用sac1切，后用bamH1切。因为后者的效率很高，可以保证切的完全
至于自连都没长，就无法解释了，抗性没有弄错吧
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淡香雅致~
29楼2012-02-22 18:56:26
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 幽香清远 at 2012-02-22 18:56:26:
我有遇到和你差不多的问题过，后来解决办法是先用sac1切，后用bamH1切。因为后者的效率很高，可以保证切的完全
至于自连都没长，就无法解释了，抗性没有弄错吧

我是先用BamHI切的，再用SacI切的。抗性没问题，哎，无语啦！！！
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坚强不是我的错
30楼2012-02-22 19:57:47
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