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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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cxnde007

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已有1人参与

连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下：
       载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！
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坚强不是我的错
1楼2012-02-20 16:57:20
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wanglei512

金虫 (正式写手)
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:40:06
引用回帖:
18楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 16:38:21:
不好意思，我写错了，是60mg/L，这个浓度相对也是比较大的吧，我今天把浓度减半又试了一下，不知道结果会怎么样，期待ing

这个浓度不高，50——100都行的。我这两天也遇到这种情况了，我自己做的电转的感受态细胞，怎么也不长，时间长了就是那种针尖状的。但是换了化转的感受态细胞长了。所以我建议你把重点放在感受态细胞上，有的时候放假回去了，回来克隆就不行了。不行就买一批新的感受态试试吧。还有就是看看你载体上的SacI和BamHI酶切位点是不是很接近，或者共用了碱基，这种情况也是连接不上的
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24楼2012-02-22 11:34:16
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wanglei512

金虫 (正式写手)
如果你的pBI121没有修改过的的话，pBI121载体上有两个BamHI的酶切位点，不知道你为啥用这个点
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25楼2012-02-22 11:38:44
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wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by wanglei512 at 2012-02-22 11:38:44:
如果你的pBI121没有修改过的的话，pBI121载体上有两个BamHI的酶切位点，不知道你为啥用这个点

如果真是这样，那么BamHI这个点是不能用的，
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26楼2012-02-22 12:08:58
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