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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-02-21 09:40:59:
个人感觉你酶切时间有点长，不知道你是否做了空载的空白对照

酶切时间长的话有什么影响呢？不是回切的更完全吗？
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坚强不是我的错
11楼2012-02-21 10:36:23
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whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:36:23:
酶切时间长的话有什么影响呢？不是回切的更完全吗？

酶切反应时间不是越长越好，容易产生非特异性切割，
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12楼2012-02-21 15:17:12
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凉亭

银虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:29:22:
现在的问题是自连都长不出菌来，还有一个问题就是，我最开始转化涂板培养后，不论培养几天都没有菌长出来，后来就是实验组、对照组都在培养两三天才长出菌来，这是为什么呢？有的菌还能在含抗生素的培养基中要起 ...

你的质粒自连 都不长的话 那就说明酶切后的质粒就有问题 还有一般平板放在37°放过夜就长出克隆来 你好几天才出来的 我想恐怕是杂菌吧 那PCR怎么会扩出来呢
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13楼2012-02-21 15:23:12
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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西瓜(金币+1): 这个是需要注意，哈哈 2012-02-22 18:42:34
’转化、涂板‘ 中间有没有37培养，所用的培养基是不加抗生素的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
14楼2012-02-21 15:35:10
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凉亭

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:35:28:
哦，谢谢。感受态没问题，回收产物也测过了，很纯的，回收时也注意了让酒精挥发的问题。不知道卡那浓度一般应该是多少啊？我的卡那工作浓度是600mg/L,这个浓度是不是高呢？转化质粒时长的满满一板，可是自连就一 ...

我觉得你的Kan浓度太高了吧 我刚才查了查自己用的 才10mg/L哎 其实自连的克隆长的少的话 是件好事 就是你转化的带有目的基因的质粒 效率很高嘛
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15楼2012-02-21 15:37:47
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by whb21 at 2012-02-21 15:17:12:
酶切反应时间不是越长越好，容易产生非特异性切割，

哦，谢谢，可是我酶切后回收跑胶检测没问题的，条带是单一的且大小也对的
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坚强不是我的错
16楼2012-02-21 16:35:02
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by fungixx at 2012-02-21 15:35:10:
’转化、涂板‘ 中间有没有37培养，所用的培养基是不加抗生素的。。。

有的，这步是没问题的，37度1h
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坚强不是我的错
17楼2012-02-21 16:35:59
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 凉亭 at 2012-02-21 15:37:47:
我觉得你的Kan浓度太高了吧 我刚才查了查自己用的 才10mg/L哎 其实自连的克隆长的少的话 是件好事 就是你转化的带有目的基因的质粒 效率很高嘛

不好意思，我写错了，是60mg/L，这个浓度相对也是比较大的吧，我今天把浓度减半又试了一下，不知道结果会怎么样，期待ing
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坚强不是我的错
18楼2012-02-21 16:38:21
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
引用回帖:
9楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:29:22:
现在的问题是自连都长不出菌来，还有一个问题就是，我最开始转化涂板培养后，不论培养几天都没有菌长出来，后来就是实验组、对照组都在培养两三天才长出菌来，这是为什么呢？有的菌还能在含抗生素的培养基中要起 ...

对照组 加的什么？
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
19楼2012-02-21 17:42:04
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by fungixx at 2012-02-21 17:42:04:
对照组 加的什么？

就是载体大片段的自连
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坚强不是我的错
20楼2012-02-21 18:04:47
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