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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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LloveG

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:56:12
双酶切的在线软件，用户名和密码都是test
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php

这个网站，怎么用户名和密码是错的？求救
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51楼2013-04-10 13:54:43
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PBI121就是不太好连，本人最近一个月构建了10个载体都是pBI121，目的片段从168-3000bp。有以下几点经验供参考：
1.我发现PBI121在大肠杆菌的拷贝低，做质粒提取时，最好达到过400ng，没有再高过，因此在提质粒是一定要有一个很好的浓度。
2.由于121载体很大14000bp左右，酶切胶回收时，回收产物浓度很低，我经常是只有10ng左右，因此实验要保证121胶回收浓度。
3.我一直用的宝生物的连接酶，你的连接酶应该没有什么问题。我一般都是16度过夜连接。当胶回收浓度低时，把10微升的连接产物加入100微升感受态中。当胶回收浓度高时，可用5微升的连接产物加入50微升感受态中。

BamHI 和SacI酶切位点 直接37h 酶切就可以了 不用分步酶切，慢切 切上5个小时吧，由于121较大，从121上切小片段比较困难。也不知你的内切酶是哪个公司的，我用的是宝生物的。你也可以选择更好的。
不知意见如何，仅供参考
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52楼2013-04-10 15:53:50
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小小萧布

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
52楼: Originally posted by 小虫子666 at 2013-04-10 15:53:50
PBI121就是不太好连，本人最近一个月构建了10个载体都是pBI121，目的片段从168-3000bp。有以下几点经验供参考：
1.我发现PBI121在大肠杆菌的拷贝低，做质粒提取时，最好达到过400ng，没有再高过，因此在提质粒是一 ...

请教一下，不知道你的连接体系是怎样，还有你成功连上的，目的片段和载体的浓度怎样，我都做了一个月了还在纠结中，求指教
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53楼2013-12-19 21:36:38
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zhaozibing55

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
39楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-04-22 11:57:13
我已经连上了，不过还是谢谢您的建议...

请问楼主你的问题是怎么解决的呢？  我也是遇到了楼主一样的问题，平板不长菌落
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54楼2015-05-15 12:02:59
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天堂魔鬼

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
55楼2019-06-13 16:57:04
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