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构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上 已有1人参与
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连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下： 载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！ |
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小虫子666
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【答案】应助回帖
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PBI121就是不太好连，本人最近一个月构建了10个载体都是pBI121，目的片段从168-3000bp。有以下几点经验供参考： 1.我发现PBI121在大肠杆菌的拷贝低，做质粒提取时，最好达到过400ng，没有再高过，因此在提质粒是一定要有一个很好的浓度。 2.由于121载体很大14000bp左右，酶切胶回收时，回收产物浓度很低，我经常是只有10ng左右，因此实验要保证121胶回收浓度。 3.我一直用的宝生物的连接酶，你的连接酶应该没有什么问题。我一般都是16度过夜连接。当胶回收浓度低时，把10微升的连接产物加入100微升感受态中。当胶回收浓度高时，可用5微升的连接产物加入50微升感受态中。 BamHI 和SacI酶切位点 直接37h 酶切就可以了 不用分步酶切，慢切 切上5个小时吧，由于121较大，从121上切小片段比较困难。也不知你的内切酶是哪个公司的，我用的是宝生物的。你也可以选择更好的。 不知意见如何，仅供参考 |
52楼2013-04-10 15:53:50
panda73
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
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你克隆不成功的现象是什么？ 如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的 如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。 关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间 |
2楼2012-02-20 22:55:32
panda73
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
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cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
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双酶切的在线软件，用户名和密码都是test http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
3楼2012-02-20 22:56:12
4楼2012-02-21 08:58:00
