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构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上 已有1人参与
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连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下： 载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！ |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的： 1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做，我们实验室也做过你说的这两个酶的分布双酶切，就是从低盐到高盐的顺序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切体系如下： 50μl的体系里加入SacI 1.2μl，DNA约1μg，其他的Buffer和水，你看着体系补就行了，酶切1.5h；然后再加大体系，扩成150μl的体系，加入BamHI2μl，Buffer和水补足。各自酶在最适的Buffer里切割。补充一下，单酶切一个之后，为了排除对下一个酶的影响，你可以高温使酶失活一下。不做这一步也行的。 2.载体和目的片段都要照着上述的步骤分布双酶切，不知道你切下来的片段大小了，如果切下来的片段大小跟留下来的差不多，建议你割胶回收，如果差别很大，就可以用生工生物的PCR产物纯化试剂盒纯化酶切后的产物。最后得到用于连接的目的片段和载体，用琼脂糖凝胶鉴定一下，条带的亮度，建议加个marker，可以估算一下DNA的分子质量，以便于下一步的连接。 3.连接体系的确定就看连接酶说明书上的就行，目的片段和载体的比例如何确定的呢，看你的目的片段和载体的大小了，如果相差的多，目的片段：载体=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。 4.最后涂板的时候，我的建议是你做上以下几个对照，卡那霉素平板上加你的感受态细胞，这个是鉴定感受态细胞有没有污染的；一个是载体自己连接 的，就是看看双酶切有没有切完全；一个是感受态细胞涂在LB平板上的，看 感受态细胞效率怎么样；这些对照和你的转化涂板同时做，就可以知道问题出在哪里了。 以上就是我的建议，希望对你有帮助。 |
38楼2012-04-20 14:12:19
panda73
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panda73
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【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
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你克隆不成功的现象是什么？ 如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的 如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。 关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间 |
2楼2012-02-20 22:55:32
panda73
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双酶切的在线软件，用户名和密码都是test http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
3楼2012-02-20 22:56:12
4楼2012-02-21 08:58:00
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