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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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cxnde007

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已有1人参与

连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下：
       载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！
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坚强不是我的错
1楼2012-02-20 16:57:20
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 10:08:12
1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的两个酶间距应该在20bp以上吧，直接双酶切不就行了，双酶切效率高些
4.目的：载体的比例
赞一下 回复此楼
无善无恶心之体
7楼2012-02-21 09:53:14
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的两个酶间距应该在20bp以上吧，直接双酶切不就行了，双酶切效率高些
4.目的：载体的比例
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无善无恶心之体
8楼2012-02-21 09:56:28
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