应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
51/1返回列表
查看: 7863  |  回复: 54
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

cxnde007

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上 已有1人参与

连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下：
       载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

杂项

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
坚强不是我的错
1楼 2012-02-20 16:57:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的两个酶间距应该在20bp以上吧，直接双酶切不就行了，双酶切效率高些
4.目的：载体的比例
赞一下(1人) 回复此楼
无善无恶心之体
8楼2012-02-21 09:56:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 55 个回答

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。
关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间
赞一下 回复此楼
2楼2012-02-20 22:55:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
双酶切的在线软件，用户名和密码都是test
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php
赞一下 回复此楼
3楼2012-02-20 22:56:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆 ...

感受态已经换过了，应该没有问题。
自连也不长菌，我的目的片段是从pmd18-simple上双酶切得到的，而且载体的双酶切也很彻底，我用酶切回收后的载体片段做转化没有菌落，这是不是说明酶切没有问题呢，我以前没做过这方面，实验室的师兄师姐也都没做过，都要愁死了
赞一下 回复此楼
坚强不是我的错
4楼2012-02-21 08:58:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 55 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂，262机械专硕 +5 嗯yyl 2026-04-08 5/250 2026-04-08 23:27 by 6781022
[考研] 求调剂 +13 柒luck 2026-04-07 13/650 2026-04-08 22:46 by 猪会飞
[考研] 293调剂 +20 yj1221 2026-04-08 21/1050 2026-04-08 22:37 by 猪会飞
[考研] 0702物理学学硕299求调剂 +4 祁柒连 2026-04-06 4/200 2026-04-08 13:56 by wutongshun
[考研] 315求调剂 +17 欣喜777 2026-04-04 18/900 2026-04-08 13:54 by hangsimei
[考研] 22408 一志愿双一流人工智能300分 四六级，数据分析国奖 +4 zzfeng123 2026-04-06 6/300 2026-04-07 21:02 by zzfeng123
[考研] 一志愿西南090202求调剂 +4 在线求有学上 2026-04-07 4/200 2026-04-07 19:47 by biomichael
[考研] 本科生物信息学，总分362 求07 08调剂 +6 q小倩1210 2026-04-06 6/300 2026-04-07 19:40 by macy2011
[考研] 085100建筑学 寻求跨专业调剂 一志愿南大294分 校级省级国家级奖项若干 踏实肯干 +3 1021075758 2026-04-06 4/200 2026-04-07 09:23 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +7 张.1 2026-04-05 7/350 2026-04-05 20:40 by 啵啵啵0119
[考研] 085400电子信息319求调剂（接受跨专业调剂） +5 星星不眨眼喽 2026-04-03 6/300 2026-04-04 21:50 by hemengdong
[考研] 341求调剂 +3 洛多罗 2026-04-02 4/200 2026-04-04 21:36 by 智能智慧
[考研] 301求调剂 +18 骆驼男人 2026-04-02 18/900 2026-04-04 20:33 by 蓝云思雨
[考研] 321求调剂 +6 认真求上学 2026-04-03 6/300 2026-04-04 19:51 by dongzh2009
[考研] 319求调剂 +4 星星不眨眼喽 2026-04-03 4/200 2026-04-04 16:25 by 中飞院空管学院�
[考研] 学硕288调剂!!! +3 小王xw123 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:20 by 啵啵啵0119
[考研] 322求调剂 +4 FZAC123 2026-04-03 4/200 2026-04-03 20:55 by zhq0425
[考研] 372分材料与化工（085600）一志愿湖南大学求调剂 +3 蓝笺片 2026-04-03 4/200 2026-04-03 17:58 by Jimmyandyou
[考研] 一志愿北京交通大学材料工程总分358 +4 cs0106 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:41 by 百灵童888
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭