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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
10楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:35:28:
哦，谢谢。感受态没问题，回收产物也测过了，很纯的，回收时也注意了让酒精挥发的问题。不知道卡那浓度一般应该是多少啊？我的卡那工作浓度是600mg/L,这个浓度是不是高呢？转化质粒时长的满满一板，可是自连就一 ...

到网上去查一下那卡霉素的工作浓度，你竟然用这么高的，没见过！
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
31楼2012-02-22 21:26:09
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dxzhaomiao

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-23 13:54:36
cxnde007: 金币+5, ★有帮助, 我连接上了，做了很多改变，但是本人觉得做主要的是载体大片段和目的片段的浓度应该大一些，连接效率也蛮高的 2012-03-19 17:55:28
我做过pBI121，连接效率是蛮低的，建议你增大载体浓度和回收产物浓度试试看。我比较倾向于是你的酶切可能有问题，你可以试试双切，或者把两个酶切顺序换一下。现在我做克隆都用重组臂重组，就是在你目标片段两端加上15~20bp的重组臂，然后和酶切过的载体重组。不管怎样不要气馁，找到原因一步步来
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32楼2012-02-23 09:12:49
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joblee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 08:58:00:
感受态已经换过了，应该没有问题。
自连也不长菌，我的目的片段是从pmd18-simple上双酶切得到的，而且载体的双酶切也很彻底，我用酶切回收后的载体片段做转化没有菌落，这是不是说明酶切没有问题呢，我以前没做 ...

感受态没问题，自连不长菌，会不会是T4连接体系的问题？连接酶或者缓冲液有问题
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33楼2012-02-23 09:24:09
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2012-02-22 21:26:09:
到网上去查一下那卡霉素的工作浓度，你竟然用这么高的，没见过！

不好意思，我写错了，不是600，是60mg/L
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坚强不是我的错
34楼2012-02-23 11:59:34
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by dxzhaomiao at 2012-02-23 09:12:49:
我做过pBI121，连接效率是蛮低的，建议你增大载体浓度和回收产物浓度试试看。我比较倾向于是你的酶切可能有问题，你可以试试双切，或者把两个酶切顺序换一下。现在我做克隆都用重组臂重组，就是在你目标片段两端加 ...

恩，谢谢
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坚强不是我的错
35楼2012-02-23 12:01:08
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by joblee at 2012-02-23 09:24:09:
感受态没问题，自连不长菌，会不会是T4连接体系的问题？连接酶或者缓冲液有问题

连接体系是10ul,连接酶和缓冲液各1ul，载体和目的基因则是换过不同的比例，这个会有问题吗？至于连接酶和缓冲液我也换过了
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坚强不是我的错
36楼2012-02-23 12:03:26
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812951300

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
36楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-23 12:03:26:
连接体系是10ul,连接酶和缓冲液各1ul，载体和目的基因则是换过不同的比例，这个会有问题吗？至于连接酶和缓冲液我也换过了

酶和缓冲液有点少吧？
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37楼2012-02-25 23:00:26
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haoying1986

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的：
1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做，我们实验室也做过你说的这两个酶的分布双酶切，就是从低盐到高盐的顺序就可以了，你可以先用SacI酶切，然后再用BamHI酶切，酶切体系如下：
50μl的体系里加入SacI 1.2μl，DNA约1μg，其他的Buffer和水，你看着体系补就行了，酶切1.5h；然后再加大体系，扩成150μl的体系，加入BamHI2μl，Buffer和水补足。各自酶在最适的Buffer里切割。补充一下，单酶切一个之后，为了排除对下一个酶的影响，你可以高温使酶失活一下。不做这一步也行的。
2.载体和目的片段都要照着上述的步骤分布双酶切，不知道你切下来的片段大小了，如果切下来的片段大小跟留下来的差不多，建议你割胶回收，如果差别很大，就可以用生工生物的PCR产物纯化试剂盒纯化酶切后的产物。最后得到用于连接的目的片段和载体，用琼脂糖凝胶鉴定一下，条带的亮度，建议加个marker，可以估算一下DNA的分子质量，以便于下一步的连接。
3.连接体系的确定就看连接酶说明书上的就行，目的片段和载体的比例如何确定的呢，看你的目的片段和载体的大小了，如果相差的多，目的片段：载体=3:1~10：1，如果差不多，就等比例加或者直接3:1做就行了。
4.最后涂板的时候，我的建议是你做上以下几个对照，卡那霉素平板上加你的感受态细胞，这个是鉴定感受态细胞有没有污染的；一个是载体自己连接
的，就是看看双酶切有没有切完全；一个是感受态细胞涂在LB平板上的，看
感受态细胞效率怎么样；这些对照和你的转化涂板同时做，就可以知道问题出在哪里了。
以上就是我的建议，希望对你有帮助。
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38楼2012-04-20 14:12:19
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
38楼: Originally posted by haoying1986 at 2012-04-20 14:12:19:
我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的：
1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做 ...

我已经连上了，不过还是谢谢您的建议
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坚强不是我的错
39楼2012-04-22 11:57:13
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆 ...

貌似这个网站进不去哦
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smile to the world
40楼2012-04-22 14:33:24
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