10楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 10:35:28:
哦，谢谢。感受态没问题，回收产物也测过了，很纯的，回收时也注意了让酒精挥发的问题。不知道卡那浓度一般应该是多少啊？我的卡那工作浓度是600mg/L,这个浓度是不是高呢？转化质粒时长的满满一板，可是自连就一 ...

4楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-21 08:58:00:
感受态已经换过了，应该没有问题。
自连也不长菌，我的目的片段是从pmd18-simple上双酶切得到的，而且载体的双酶切也很彻底，我用酶切回收后的载体片段做转化没有菌落，这是不是说明酶切没有问题呢，我以前没做 ...

楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2012-02-22 21:26:09:
到网上去查一下那卡霉素的工作浓度，你竟然用这么高的，没见过！

楼: Originally posted by dxzhaomiao at 2012-02-23 09:12:49:
我做过pBI121，连接效率是蛮低的，建议你增大载体浓度和回收产物浓度试试看。我比较倾向于是你的酶切可能有问题，你可以试试双切，或者把两个酶切顺序换一下。现在我做克隆都用重组臂重组，就是在你目标片段两端加 ...

楼: Originally posted by joblee at 2012-02-23 09:24:09:
感受态没问题，自连不长菌，会不会是T4连接体系的问题？连接酶或者缓冲液有问题

36楼: Originally posted by cxnde007 at 2012-02-23 12:03:26:
连接体系是10ul,连接酶和缓冲液各1ul，载体和目的基因则是换过不同的比例，这个会有问题吗？至于连接酶和缓冲液我也换过了

38楼: Originally posted by haoying1986 at 2012-04-20 14:12:19:
我也做过重组的质粒的构建，同样的问题我也遇见过。应该是这样的：
1.你做酶切的时候时间过长了，分布双酶切时，每个酶的酶切时间最多也就两个小时，酶的用量，你可以查阅酶的说明书。你的分布双酶切没必要那么做 ...

2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆 ...