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构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已有1人参与
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连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下： 载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！ |
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dxzhaomiao
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-23 13:54:36
cxnde007: 金币+5, ★有帮助, 我连接上了，做了很多改变，但是本人觉得做主要的是载体大片段和目的片段的浓度应该大一些，连接效率也蛮高的 2012-03-19 17:55:28
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小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-23 13:54:36
cxnde007: 金币+5, ★有帮助, 我连接上了，做了很多改变，但是本人觉得做主要的是载体大片段和目的片段的浓度应该大一些，连接效率也蛮高的 2012-03-19 17:55:28
我做过pBI121，连接效率是蛮低的，建议你增大载体浓度和回收产物浓度试试看。我比较倾向于是你的酶切可能有问题，你可以试试双切，或者把两个酶切顺序换一下。现在我做克隆都用重组臂重组，就是在你目标片段两端加上15~20bp的重组臂，然后和酶切过的载体重组。不管怎样不要气馁，找到原因一步步来 |
32楼2012-02-23 09:12:49