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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
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cxnde007

铜虫 (小有名气)

[求助] 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上 已有1人参与

连续做了两个多月的表达载体构建了，始终不成功，希望各位大侠给与指点，具体情况如下：
       载体为pBI121,目的基因700bp左右（两端分别加有BamHI 和SacI酶切位点，连接在pmd18-simple上），用这两个酶分别对pBI121和目的基因进行双酶切（先是BamHI 30度 4h,沉淀回收后SacI 37度 4h），电泳检测（酶切完全）并回收，回收后电泳检测条带清晰可见，且大小也是对的。将回收的载体片段与目的基因用连接酶连接（用过宝生物的T4连接酶，现改为NEB的），转化、涂板，来来回回做了不知道多少遍了，现在是在是不知道该怎么办了，哪位做过、遇到过这些问题的大侠帮帮吧，谢谢啦！
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坚强不是我的错
1楼 2012-02-20 16:57:20
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-21 09:56:28:
1.感受态细胞是否好使。载体卡那抗性的需要复苏一个小时，还有涂板是玻璃棒不要用力
2.回收产物是否纯净，测一下目的片段和载体的OD值，260，280，230。
  回收时酒精是否挥发干净了，不然会影响连接的
3.你的 ...

哦，谢谢。感受态没问题，回收产物也测过了，很纯的，回收时也注意了让酒精挥发的问题。不知道卡那浓度一般应该是多少啊？我的卡那工作浓度是600mg/L,这个浓度是不是高呢？转化质粒时长的满满一板，可是自连就一个也没有，纠结中，快崩溃了！
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坚强不是我的错
10楼2012-02-21 10:35:28
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-02-21 08:31:02
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆，表明你的载体处理有问题。如果自连和目的对照都无克隆，可能是感受态有问题或PCR产物的酶切有问题。
关于分子克隆中的酶切设计，我觉得一个在线软件很好用，能够精确计算双酶切时所需的酶的精确用量（再也不用猜测酶量用得够不够了）还能推荐双酶切的最优buffer，使用很方便，而且现在还可以免费使用，用户名和密码都是test，你可以试一试，相信节省你做克隆的时间
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2楼2012-02-20 22:55:32
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励热心虫虫 2012-02-22 18:41:00
cxnde007: 金币+1, ★有帮助 2012-04-26 09:27:14
双酶切的在线软件，用户名和密码都是test
http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php
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3楼2012-02-20 22:56:12
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cxnde007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-20 22:55:32:
你克隆不成功的现象是什么？
如果是无克隆：那可能是你的感受态不好用，可以订购新的
如果是无阳性克隆：我建议你做一个空载体的自连对照（即设计一个用水代替700bp片段的平行对照），如果自连对照也长很多克隆 ...

感受态已经换过了，应该没有问题。
自连也不长菌，我的目的片段是从pmd18-simple上双酶切得到的，而且载体的双酶切也很彻底，我用酶切回收后的载体片段做转化没有菌落，这是不是说明酶切没有问题呢，我以前没做过这方面，实验室的师兄师姐也都没做过，都要愁死了
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坚强不是我的错
4楼2012-02-21 08:58:00
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