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hooroberts新虫 (小有名气)
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gst标签,蛋白纯化
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大家看看我这目的蛋白,在上清中纯化有希望吗,gst标签的,整了几次没出来,放好久了 ,如果不行的话是不是纯化包涵体也行,gst的是不是变性后腰先复性再纯化,如果复性的话怎么复性?做酶活的,对量不要求多大。![]() |
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7楼2011-06-30 14:54:53
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4楼2011-06-29 10:05:54
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【答案】应助回帖
hooroberts(金币+8): 妹子威武!!哎,不过还是感觉希望不大,能直接用上清做阴性对照做酶活吗? 2011-06-29 23:48:31
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
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1、上清纯化当然有希望了,GST标签特异性很好的,楼主不要嫌量少,纯化时GST介质不要装太多,纯化完后会有浓缩效果。 2、尽管GST是亲水蛋白,融合以后这么大的分子量还想上清表达量大,基本不可能。 3、纯化包涵体还是不推荐,GST标签的结合是和GST的构象相关的,包涵体纯化就肯定要做复性,而且你的复性条件既要保证GST的构象回复正常(这点做不到标签不能用来纯化),还要保证你的目的蛋白构象回复正常(这点做不到你的蛋白没活性)。 4、如果非要做包涵体,His标签优于gst,你完全可以在变性条件(尿素中)下纯化,纯化完再做复性。 5、复性就是通过稀释或透析把尿素等变性剂一次性或逐步除去,让蛋白逐渐恢复天然构象,以可溶状态出现的过程,具体条件不同的蛋白是不一样的,要自己去摸索。一般就是缓冲液啊,盐浓度之类的。 |
5楼2011-06-29 20:08:12
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