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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签，蛋白纯化
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hooroberts

新虫 (小有名气)

[求助] gst标签，蛋白纯化

大家看看我这目的蛋白，在上清中纯化有希望吗，gst标签的，整了几次没出来，放好久了，如果不行的话是不是纯化包涵体也行，gst的是不是变性后腰先复性再纯化，如果复性的话怎么复性？做酶活的，对量不要求多大。
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1楼2011-06-27 22:55:24
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by 693137546 at 2011-06-27 23:08:46:
建议楼主不要做包涵体呀

不到必要时我也不想
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3楼2011-06-28 21:48:29
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 17:52:01:
上清里有你的目的蛋白啊，不能拿来做阴性对照。

我的意思是用空载体或者诱导前的上清做阴性对照
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9楼2011-06-30 18:56:52
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by 落明逐暗 at 2011-06-30 14:54:53:
请教楼主蛋白胶是用什么摄像系统拍的？染色剂和脱色剂是什么？胶跑得相当漂亮！

我是用分析双向电泳的扫描仪拍的，染色跟脱色跟普通考染一样
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11楼2011-06-30 18:59:53
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 18:58:57:
这样呀，那OK啊，祝楼主好运，实验顺利！

用诱导前的上清当阴性对照，诱导后上清不分离直接做酶活性可以？
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12楼2011-06-30 19:02:49
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 19:16:23:
“上清不分离做酶活”——这个难说啊，毕竟上清那么多杂蛋白，谁知道会不会干扰呢

哎，而且还是个蛋白酶，只检测其蛋白酶活性，悲催啊
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14楼2011-06-30 20:17:33
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hooroberts

新虫 (小有名气)
还是疏水性膜蛋白，是不是不要指望了啊，我构建了4个表达载体，只有一个诱导出来了
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17楼2011-06-30 21:04:08
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 20:59:07:
原来是蛋白酶啊，那要纯化了才能测啊。
而且是蛋白酶的话，就更不要指望表达量能高了，这类蛋白对细胞都是有毒性的，表达量不可能大。

还是疏水性膜蛋白，是不是不要指望了啊，我构建了4个表达载体，只有一个诱导出来了
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18楼2011-06-30 22:18:51
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by toxicpeach at 2011-06-30 23:57:31:
楼主确定你的目标条带就是表达的蛋白么？之前我们遇到过表达膜蛋白，诱导前后或者诱导与未诱导的相比较都有特异性的目标条带大小的蛋白出现，但是用标签的抗体(His单抗)做Western Blot杂交，居然没有做出来，那个 ...

其实我也考虑过的，可是与目的融合蛋白大小相等，而且包涵体中还是挺多的，我只是没有放在这而已，这么大的应激蛋白应该少，western blot的话我也做过一次，用的是目的蛋白抗体，显色时好多带，后面也没有时间做了。不了了之
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20楼2011-07-01 00:04:31
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hooroberts

新虫 (小有名气)
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Originally posted by toxicpeach at 2011-07-01 12:31:33:
那你用包涵体做一次杂交嘛，至少包涵体洗洗就比较纯了。不做杂交还是不放心啊，我师弟就是怎么纯化也没有目的条带才想到做杂交的，结果果然不是，也不排除可溶的那点和包涵体根本就不是一个东西，但是一般有包涵体 ...

表达的应该确实是目的蛋白，因为又一次我用盐酸胍溶解包涵体没有复性做了次纯化elution buffer 中有一条淡淡的带
培养基我一直用LB，基础培养基有更好吗
去垢剂增溶的话我都是在超声波破碎之前用np40增容的
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22楼2011-07-01 14:03:24
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