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hooroberts新虫 (小有名气)
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[求助]
gst标签，蛋白纯化
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大家看看我这目的蛋白，在上清中纯化有希望吗，gst标签的，整了几次没出来，放好久了 ，如果不行的话是不是纯化包涵体也行，gst的是不是变性后腰先复性再纯化，如果复性的话怎么复性？做酶活的，对量不要求多大。  |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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hooroberts
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【答案】应助回帖
hooroberts(金币+8): 妹子威武！！哎，不过还是感觉希望不大，能直接用上清做阴性对照做酶活吗? 2011-06-29 23:48:31
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
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1、上清纯化当然有希望了，GST标签特异性很好的，楼主不要嫌量少，纯化时GST介质不要装太多，纯化完后会有浓缩效果。 2、尽管GST是亲水蛋白，融合以后这么大的分子量还想上清表达量大，基本不可能。 3、纯化包涵体还是不推荐，GST标签的结合是和GST的构象相关的，包涵体纯化就肯定要做复性，而且你的复性条件既要保证GST的构象回复正常（这点做不到标签不能用来纯化），还要保证你的目的蛋白构象回复正常（这点做不到你的蛋白没活性）。 4、如果非要做包涵体，His标签优于gst，你完全可以在变性条件（尿素中）下纯化，纯化完再做复性。 5、复性就是通过稀释或透析把尿素等变性剂一次性或逐步除去，让蛋白逐渐恢复天然构象，以可溶状态出现的过程，具体条件不同的蛋白是不一样的，要自己去摸索。一般就是缓冲液啊，盐浓度之类的。 |
5楼2011-06-29 20:08:12
