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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签，蛋白纯化
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hooroberts

新虫 (小有名气)

[求助] gst标签，蛋白纯化

大家看看我这目的蛋白，在上清中纯化有希望吗，gst标签的，整了几次没出来，放好久了，如果不行的话是不是纯化包涵体也行，gst的是不是变性后腰先复性再纯化，如果复性的话怎么复性？做酶活的，对量不要求多大。
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1楼2011-06-27 22:55:24
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 693137546 at 2011-06-27 23:08:46:
建议楼主不要做包涵体呀

不到必要时我也不想
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3楼2011-06-28 21:48:29
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693137546

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

建议楼主不要做包涵体呀
赞一下 回复此楼
大风气息云飞扬
2楼2011-06-27 23:08:46
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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长

【答案】应助回帖

hooroberts(金币+2): 试过，16度，0.15mmol，24小时，没效果。 2011-06-29 23:51:13
建议楼主降低发酵温度和转速，延长发酵时间，这样应该会提高在上清中的表达量。30℃，200rpm，6-7小时应该不错。之后再进行纯化就能有合适的上样量。不然上样量太低也没有好的纯化效果。光凭图的话，真的量太少了。
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天涯静处无征战，兵气销为日月光。
4楼2011-06-29 10:05:54
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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

hooroberts(金币+8): 妹子威武！！哎，不过还是感觉希望不大，能直接用上清做阴性对照做酶活吗? 2011-06-29 23:48:31
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
1、上清纯化当然有希望了，GST标签特异性很好的，楼主不要嫌量少，纯化时GST介质不要装太多，纯化完后会有浓缩效果。
2、尽管GST是亲水蛋白，融合以后这么大的分子量还想上清表达量大，基本不可能。
3、纯化包涵体还是不推荐，GST标签的结合是和GST的构象相关的，包涵体纯化就肯定要做复性，而且你的复性条件既要保证GST的构象回复正常（这点做不到标签不能用来纯化），还要保证你的目的蛋白构象回复正常（这点做不到你的蛋白没活性）。
4、如果非要做包涵体，His标签优于gst，你完全可以在变性条件（尿素中）下纯化，纯化完再做复性。
5、复性就是通过稀释或透析把尿素等变性剂一次性或逐步除去，让蛋白逐渐恢复天然构象，以可溶状态出现的过程，具体条件不同的蛋白是不一样的，要自己去摸索。一般就是缓冲液啊，盐浓度之类的。
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5楼2011-06-29 20:08:12
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