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zsy1106

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

hooroberts(金币+8): 妹子威武!!哎,不过还是感觉希望不大,能直接用上清做阴性对照做酶活吗? 2011-06-29 23:48:31
silicare(EPI+1): 2011-06-30 15:14:42
1、上清纯化当然有希望了,GST标签特异性很好的,楼主不要嫌量少,纯化时GST介质不要装太多,纯化完后会有浓缩效果。
2、尽管GST是亲水蛋白,融合以后这么大的分子量还想上清表达量大,基本不可能。
3、纯化包涵体还是不推荐,GST标签的结合是和GST的构象相关的,包涵体纯化就肯定要做复性,而且你的复性条件既要保证GST的构象回复正常(这点做不到标签不能用来纯化),还要保证你的目的蛋白构象回复正常(这点做不到你的蛋白没活性)。
4、如果非要做包涵体,His标签优于gst,你完全可以在变性条件(尿素中)下纯化,纯化完再做复性。
5、复性就是通过稀释或透析把尿素等变性剂一次性或逐步除去,让蛋白逐渐恢复天然构象,以可溶状态出现的过程,具体条件不同的蛋白是不一样的,要自己去摸索。一般就是缓冲液啊,盐浓度之类的。
5楼2011-06-29 20:08:12
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