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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签，蛋白纯化
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
那你用包涵体做一次杂交嘛，至少包涵体洗洗就比较纯了。不做杂交还是不放心啊，我师弟就是怎么纯化也没有目的条带才想到做杂交的，结果果然不是，也不排除可溶的那点和包涵体根本就不是一个东西，但是一般有包涵体的话，可溶的也会存在。
另外，楼主用的是什么培养基呢？可以考虑一下基础培养基，低温诱导，可以减少包涵体产生。
膜蛋白不知道你是用什么去垢剂增溶的，溶液里面要用合适的去垢剂才行，好像我们这里纯化膜蛋白都不仅仅是去掉包涵体，收上清，上清还要再高速离心很久，收沉淀，重新溶在有去垢剂的缓冲液里面才能再做纯化。
昨天没有考虑到你做的是膜蛋白，今天又看了下，你这样可能膜还是没有分离好，直接纯化不行的。
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
21楼2011-07-01 12:31:33
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by toxicpeach at 2011-07-01 12:31:33:
那你用包涵体做一次杂交嘛，至少包涵体洗洗就比较纯了。不做杂交还是不放心啊，我师弟就是怎么纯化也没有目的条带才想到做杂交的，结果果然不是，也不排除可溶的那点和包涵体根本就不是一个东西，但是一般有包涵体 ...

表达的应该确实是目的蛋白，因为又一次我用盐酸胍溶解包涵体没有复性做了次纯化elution buffer 中有一条淡淡的带
培养基我一直用LB，基础培养基有更好吗
去垢剂增溶的话我都是在超声波破碎之前用np40增容的
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22楼2011-07-01 14:03:24
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
超声破碎之前就用NP-40增溶的话，相当于把可溶的和膜的那部分都混在一起了，纯化的时候更麻烦一点，相当于要从更多的蛋白中纯化出目标蛋白，对于柱子来说，载量是一定的，不是最好的选择，可以尝试我说的那种方法。
A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation
NATURE PROTOCOLS | VOL.4 NO.5 | 2009 |619
你可以看一下
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
23楼2011-07-01 22:38:25
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rhguo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1732794楼: Originally posted by 落明逐暗 at 2011-06-29 10:05:54:
建议楼主降低发酵温度和转速，延长发酵时间，这样应该会提高在上清中的表达量。30℃，200rpm，6-7小时应该不错。之后再进行纯化就能有合适的上样量。不然上样量太低也没有好的纯化效果。光凭图的话，真的量太少了。

蛋碎啊，低温也没有用得
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24楼2012-04-27 17:26:07
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rhguo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1755930楼: Originally posted by zsy1106 at 2011-06-29 20:08:12:
1、上清纯化当然有希望了，GST标签特异性很好的，楼主不要嫌量少，纯化时GST介质不要装太多，纯化完后会有浓缩效果。
2、尽管GST是亲水蛋白，融合以后这么大的分子量还想上清表达量大，基本不可能。
3、纯化包涵 ...

太低了，上清中的含量
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25楼2012-04-27 17:26:20
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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长
低温也没办法的话，发酵条件这边能改进的也就没啥了。。。楼主你就老老实实做变性溶解包涵体再复性吧。。。
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天涯静处无征战，兵气销为日月光。
26楼2012-04-28 09:52:17
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