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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签，蛋白纯化
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 落明逐暗 at 2011-06-30 14:54:53:
请教楼主蛋白胶是用什么摄像系统拍的？染色剂和脱色剂是什么？胶跑得相当漂亮！

我是用分析双向电泳的扫描仪拍的，染色跟脱色跟普通考染一样
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11楼2011-06-30 18:59:53
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 18:58:57:
这样呀，那OK啊，祝楼主好运，实验顺利！

用诱导前的上清当阴性对照，诱导后上清不分离直接做酶活性可以？
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12楼2011-06-30 19:02:49
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zsy1106

金虫 (小有名气)
“上清不分离做酶活”——这个难说啊，毕竟上清那么多杂蛋白，谁知道会不会干扰呢
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13楼2011-06-30 19:16:23
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 19:16:23:
“上清不分离做酶活”——这个难说啊，毕竟上清那么多杂蛋白，谁知道会不会干扰呢

哎，而且还是个蛋白酶，只检测其蛋白酶活性，悲催啊
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14楼2011-06-30 20:17:33
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zsy1106

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hooroberts at 2011-06-30 20:17:33:
哎，而且还是个蛋白酶，只检测其蛋白酶活性，悲催啊

原来是蛋白酶啊，那要纯化了才能测啊。
而且是蛋白酶的话，就更不要指望表达量能高了，这类蛋白对细胞都是有毒性的，表达量不可能大。
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15楼2011-06-30 20:53:00
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zsy1106

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hooroberts at 2011-06-30 20:17:33:
哎，而且还是个蛋白酶，只检测其蛋白酶活性，悲催啊

原来是蛋白酶啊，那要纯化了才能测啊。
而且是蛋白酶的话，就更不要指望表达量能高了，这类蛋白对细胞都是有毒性的，表达量不可能大。
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16楼2011-06-30 20:59:07
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hooroberts

新虫 (小有名气)
还是疏水性膜蛋白，是不是不要指望了啊，我构建了4个表达载体，只有一个诱导出来了
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17楼2011-06-30 21:04:08
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-06-30 20:59:07:
原来是蛋白酶啊，那要纯化了才能测啊。
而且是蛋白酶的话，就更不要指望表达量能高了，这类蛋白对细胞都是有毒性的，表达量不可能大。

还是疏水性膜蛋白，是不是不要指望了啊，我构建了4个表达载体，只有一个诱导出来了
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18楼2011-06-30 22:18:51
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
楼主确定你的目标条带就是表达的蛋白么？之前我们遇到过表达膜蛋白，诱导前后或者诱导与未诱导的相比较都有特异性的目标条带大小的蛋白出现，但是用标签的抗体(His单抗)做Western Blot杂交，居然没有做出来，那个条带不是我们需要的带标签的目标蛋白，是一个诱导后出现的细菌应激反应的蛋白。我还比较过我一次没有表达目标蛋白的细菌裂解物，诱导前后不同的蛋白条带非常多，可能有4-5条，只不过恰好都不在我要的大小，才避免了。建议楼主先做个Western Blot，用GST的抗体杂交一下，以免像我们一样走弯路。毕竟我以前做GST纯化的时候还是非常好做的。
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
19楼2011-06-30 23:57:31
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hooroberts

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by toxicpeach at 2011-06-30 23:57:31:
楼主确定你的目标条带就是表达的蛋白么？之前我们遇到过表达膜蛋白，诱导前后或者诱导与未诱导的相比较都有特异性的目标条带大小的蛋白出现，但是用标签的抗体(His单抗)做Western Blot杂交，居然没有做出来，那个 ...

其实我也考虑过的，可是与目的融合蛋白大小相等，而且包涵体中还是挺多的，我只是没有放在这而已，这么大的应激蛋白应该少，western blot的话我也做过一次，用的是目的蛋白抗体，显色时好多带，后面也没有时间做了。不了了之
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20楼2011-07-01 00:04:31
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