应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签，蛋白纯化
41/1返回列表
查看: 2742  |  回复: 25
查看全部回帖@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

hooroberts

新虫 (小有名气)

[求助] gst标签，蛋白纯化

大家看看我这目的蛋白，在上清中纯化有希望吗，gst标签的，整了几次没出来，放好久了，如果不行的话是不是纯化包涵体也行，gst的是不是变性后腰先复性再纯化，如果复性的话怎么复性？做酶活的，对量不要求多大。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2011-06-27 22:55:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

toxicpeach

木虫 (正式写手)
楼主确定你的目标条带就是表达的蛋白么？之前我们遇到过表达膜蛋白，诱导前后或者诱导与未诱导的相比较都有特异性的目标条带大小的蛋白出现，但是用标签的抗体(His单抗)做Western Blot杂交，居然没有做出来，那个条带不是我们需要的带标签的目标蛋白，是一个诱导后出现的细菌应激反应的蛋白。我还比较过我一次没有表达目标蛋白的细菌裂解物，诱导前后不同的蛋白条带非常多，可能有4-5条，只不过恰好都不在我要的大小，才避免了。建议楼主先做个Western Blot，用GST的抗体杂交一下，以免像我们一样走弯路。毕竟我以前做GST纯化的时候还是非常好做的。
赞一下 回复此楼
海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
19楼2011-06-30 23:57:31
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

toxicpeach

木虫 (正式写手)
那你用包涵体做一次杂交嘛，至少包涵体洗洗就比较纯了。不做杂交还是不放心啊，我师弟就是怎么纯化也没有目的条带才想到做杂交的，结果果然不是，也不排除可溶的那点和包涵体根本就不是一个东西，但是一般有包涵体的话，可溶的也会存在。
另外，楼主用的是什么培养基呢？可以考虑一下基础培养基，低温诱导，可以减少包涵体产生。
膜蛋白不知道你是用什么去垢剂增溶的，溶液里面要用合适的去垢剂才行，好像我们这里纯化膜蛋白都不仅仅是去掉包涵体，收上清，上清还要再高速离心很久，收沉淀，重新溶在有去垢剂的缓冲液里面才能再做纯化。
昨天没有考虑到你做的是膜蛋白，今天又看了下，你这样可能膜还是没有分离好，直接纯化不行的。
赞一下 回复此楼
海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
21楼2011-07-01 12:31:33
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

toxicpeach

木虫 (正式写手)
超声破碎之前就用NP-40增溶的话，相当于把可溶的和膜的那部分都混在一起了，纯化的时候更麻烦一点，相当于要从更多的蛋白中纯化出目标蛋白，对于柱子来说，载量是一定的，不是最好的选择，可以尝试我说的那种方法。
A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation
NATURE PROTOCOLS | VOL.4 NO.5 | 2009 |619
你可以看一下
赞一下 回复此楼
海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
23楼2011-07-01 22:38:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hooroberts 的主题更新
41/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭