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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收产物连接转化后菌液PCR电泳条带出现问题
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] 胶回收产物连接转化后菌液PCR电泳条带出现问题

我的cDNA胶回收后条带约1000kb强，之后连接到T载体上（将回收产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，胶回收DNA4.5微，T载体 0.5微，SolutionI  5微升），之后转化到天根公司Ｅ.ｃｏｌｉ感受态细胞中，接菌，挑菌后摇菌。之后菌液ＰＣＲ（自己的引物和Ｍ１３引物分别跑了都差不多），可是电泳条带发生改变，出现了２０００多ｋｂ的条带。
各位学长学姐，请问这是怎么回事？好像出现了ｃＤＮＡ自己连接起来的现象。还有如何解决？本人小虫，没啥金币，还望见谅。
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无善无恶心之体
1楼 2011-06-10 13:56:19
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)
上面写错了，我的cDNA为1kb多点，不是1000kb，后面2kb多点，嘿嘿。
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无善无恶心之体
2楼2011-06-10 14:52:13
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healerly

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2011-06-10 14:56:16
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): epi大神 2011-06-10 15:14:34
zhiqiang5070(金币+3): 你很厉害啊，可能是没连上，剩余的带应该是空载体和非特异性产物 2011-06-13 08:38:28
着实感觉很奇怪，应该是一条1KB的条带。。。
考虑没有连接上的情况，2kb很有可能是非特异性条带；
建议：
1:重新进行连接，我看你的连接体系中DNA有点太多了，可以是载体的2-3倍（浓度，这个需要你跑胶定量的）；
2：将你现在疑似含有重组载体的菌划至平板上，提取质粒，先看看能不能提取出来，能的话再做一个酶切看看。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-10 15:07:59
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你下面的图片是什么marker啊，这么像1KB ladder 啊，那带是1k吗？每个公司的marker不一样大哦。会不会cDNA没有扩出来，而正好有gDNA污染，扩出来的是含内含子的片段啊。
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生命不息，探索不止。
5楼2011-06-10 20:56:37
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hellolin

金虫 (小有名气)
不知道楼主解决了这个问题了没有，我现在也遇到了相似的问题啊，求指教！！！
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scienceguy
6楼2011-10-28 17:30:23
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-13 18:26:21
2k多的带应该是T载体本身，你的菌液裂解物加多了

没有你的目的条带的话应该是没有连接上
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7楼2011-12-13 07:59:21
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2314060楼: Originally posted by dnaxxx at 2011-12-13 07:59:21:
2k多的带应该是T载体本身，你的菌液裂解物加多了

没有你的目的条带的话应该是没有连接上

同意.
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为什么
8楼2012-05-10 18:56:22
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)
应该是载体的DNA条带；
1）你的载体片段是否在2000-3000bp的范围
2）你的目的片段没有连接成功，培养后增值的知识原来的载体，而无目的片段
建议：
提取质粒，用你的质粒作为对照，与剩余的PCR产物进行电泳，如果质粒的条带与PCR的条带出现亮带的位置一致，则可以确定确实为载体的DNA。
3）建议重新连接转化吧
赞一下 回复此楼
9楼2014-08-13 17:52:24
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