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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] 胶回收产物连接转化后菌液PCR电泳条带出现问题

我的cDNA胶回收后条带约1000kb强,之后连接到T载体上(将回收产物与pMD18-T载体16℃连接过夜,胶回收DNA4.5微,T载体 0.5微,SolutionI  5微升),之后转化到天根公司E.coli感受态细胞中,接菌,挑菌后摇菌。之后菌液PCR(自己的引物和M13引物分别跑了都差不多),可是电泳条带发生改变,出现了2000多kb的条带。
各位学长学姐,请问这是怎么回事?好像出现了cDNA自己连接起来的现象。还有如何解决?本人小虫,没啥金币,还望见谅。
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无善无恶心之体
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liuyancheng

新虫 (初入文坛)

应该是载体的DNA条带;
1)你的载体片段是否在2000-3000bp的范围
2)你的目的片段没有连接成功,培养后增值的知识原来的载体,而无目的片段
建议:
提取质粒,用你的质粒作为对照,与剩余的PCR产物进行电泳,如果质粒的条带与PCR的条带出现亮带的位置一致,则可以确定确实为载体的DNA。
3)建议重新连接转化吧
9楼2014-08-13 17:52:24
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

上面写错了,我的cDNA为1kb多点,不是1000kb,后面2kb多点,嘿嘿。

无善无恶心之体
2楼2011-06-10 14:52:13
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healerly

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

3楼2011-06-10 14:56:16
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): epi大神 2011-06-10 15:14:34
zhiqiang5070(金币+3): 你很厉害啊,可能是没连上,剩余的带应该是空载体和非特异性产物 2011-06-13 08:38:28
着实感觉很奇怪,应该是一条1KB的条带。。。
考虑没有连接上的情况,2kb很有可能是非特异性条带;
建议:
1:重新进行连接,我看你的连接体系中DNA有点太多了,可以是载体的2-3倍(浓度,这个需要你跑胶定量的);
2:将你现在疑似含有重组载体的菌划至平板上,提取质粒,先看看能不能提取出来,能的话再做一个酶切看看。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-10 15:07:59
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