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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物测序问题
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las_vip086

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序问题 已有5人参与

引物用的27F/1492R退火温度分别采用55和58度，电泳跑出来条带都很好，亮度也差不多，不知道拿55还是58度的PCR产物好呢，谢谢！
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1楼 2010-08-03 12:59:19
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shuiyue2728

新虫 (正式写手)
las_vip086(金币+1): 2010-08-03 13:28:03
建议割胶回收，连到T载体上，电专涂板，摇菌提质粒，质粒测序
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2楼2010-08-03 13:09:17
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las_vip086

木虫 (小有名气)
我是想做克隆文库，样品DNA为环境复杂样品，个人打算直接把PCR产物交给测序公司让他们纯化后铺板挑选100个克隆进行测序。
后续我不想自己再麻烦了，像我这样是送55度产物还是58度PCR产物好呢？谢谢！
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3楼2010-08-03 13:31:17
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njauzx

金虫 (小有名气)
弱弱问一下，那两个引物是什么原理？
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4楼2010-08-03 13:38:23
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las_vip086

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by njauzx at 2010-08-03 13:38:23:
弱弱问一下，那两个引物是什么原理？

不太明白你的意思，因为我不是搞微生物的。做环境的我看很多文献都是用27f/1492r这对通用引物来检测水处理中微生物种类构成。所以我就选择了这对引物，这个是没有问题的。
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5楼2010-08-03 13:44:41
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
las_vip086(金币+1): 2010-08-03 14:01:32
55和58都能很好的P出条带，是不是就一条单一的特异性条带，如果是，那两个温度P出来的都可以送去测序，结果是一样的，没有什么区别。
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6楼2010-08-03 13:53:04
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
las_vip086(金币+1): 2010-08-03 14:01:38
样品DNA为环境复杂样品？你是想知道环境中的微生物种类吗？
你又不想做T克隆筛选，想让公司帮你做是吗？
那还是用55度吧，一般鉴定细菌的时候都是55度。一般温度越高，特异性越好，P不出来的可能越大。
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7楼2010-08-03 13:57:26
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las_vip086

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fykxy_206 at 2010-08-03 13:57:26:
样品DNA为环境复杂样品？你是想知道环境中的微生物种类吗？
你又不想做T克隆筛选，想让公司帮你做是吗？
那还是用55度吧，一般鉴定细菌的时候都是55度。一般温度越高，特异性越好，P不出来的可能越大。

是的，是让公司做，55和58度都可以P出来的，电泳的条带都是一条，都在1500bp左右，结果都很好的。
谢谢你！
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8楼2010-08-03 14:03:31
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dcb005

金虫 (著名写手)
las_vip086(金币+1): 2010-08-03 14:42:36
当然任何一个都可以，温度差3度，没有任何影响，放心吧，随便选一个
不过最好连T载体，PCR测序测不全的
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
9楼2010-08-03 14:42:00
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las_vip086

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dcb005 at 2010-08-03 14:42:00:
当然任何一个都可以，温度差3度，没有任何影响，放心吧，随便选一个
不过最好连T载体，PCR测序测不全的

汗，我连T载体是什么东东都不知道，自然也无法做了，是T-RFLP吗？这个我们这边没有条件做，要是做RFLP还行，但觉得太麻烦了，呵呵。
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10楼2010-08-03 14:44:44
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