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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关测序问题，为什么送菌液不直接送PCR产物
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qaz139687

新虫 (小有名气)

[求助] 有关测序问题，为什么送菌液不直接送PCR产物 已有9人参与

做基因的，为什么要割胶回收，连接转化摇菌后送菌液，而不是直接用前面的PCR产物呢
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1楼 2015-01-02 13:24:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ls2046

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qaz139687: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 非常有帮助 2015-01-04 16:40:08
在测序的过程中，两端各有20-50bp，是无法准确阅读的，参考性比较低，这是测序技术本身存在的问题，无法避免。连接载体后，使用载体上的序列作为测序引物，那么你的片段就能够读全了（可靠性低的序列会位于在载体上）。如果基因两端的局部序列正确与否对你对结果的判断没有影响的话，完全可以用PCR产物直接测序（测序公司都要的），相反，则需要连接载体并用载体上的引物进行测序。我们做菌种大批量鉴定时都是使用PCR产物直接测序。因此，是连接载体还是用PCR产物，主要是看你测序的目的。ok。
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一品黄山
6楼2015-01-04 09:30:22
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普通回帖

冉兆星

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-02 18:20:52
PCR产物在后续的操作（割胶回收、连接转化）中可能会发生基因突变。最终我们想要得到的是含有目的基因的菌，所以要用菌液测序。当然你也可以抽菌的质粒测序，但这种方法相对于直接用菌液测序来说费时费力。
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2楼2015-01-02 14:39:17
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
因为转化摇菌后的质粒DNA是重组分子克隆。而PCR产物是细胞外扩增产物，扩增的保真性没有细胞内系统高，即使测序成功，克隆化后还是需要测序的。
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慎思明辨博学笃行
3楼2015-01-03 09:48:09
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

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菌液是纯化以后的，PCR产物可能有杂带，不好测序！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
4楼2015-01-03 09:55:07
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2015-01-03 09:55:07
菌液是纯化以后的，PCR产物可能有杂带，不好测序！

那如果PCR出来的就只有单一的一条带呢 那可以直接送PCR产物吗
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5楼2015-01-03 10:38:10
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jingyu501

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-01-04 10:35:06
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

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pcr product两头测不准
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8楼2015-01-04 10:43:08
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你最后要啥就测啥呗

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修身、齐家、治国、平天下
9楼2015-01-04 10:50:49
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-01-03 10:38:10
那如果PCR出来的就只有单一的一条带呢 那可以直接送PCR产物吗...

觉得不可行，都是目的条带大小的PCR产物也可能是混合物啊，但是连接质粒转化后，每个单克隆连接的都是同一个片段。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-01-04 11:00:45
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