应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长bp的片段的连接问题。
131/2返回列表12下一页
查看: 1466  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

leisure93

新虫 (初入文坛)

[求助] 长bp的片段的连接问题。 已有3人参与

目的基因片段长度11kb左右。为了把他扩出来 分成了三段。part-1.2.3。part-1前段加入启动子。末端加了三个酶切位点。在part-2中加了几个内含子。part-3加了个荧光蛋白。现在part1.2.3都扩出来了，也验证过了，本来是想part-1.和part-2先连接后和part3连接。可是part1.2的连接一直不成功。导致实验没法继续进行，选用的是T-1载体。其中一些假阳性 连接时长 等问题都排除过了，也换过短的质粒 一直没能连接成功。重新加酶切位点也不太可能了，求助是不是长bp的片段链接应该需要注意什么？ part1.2.3的长度大约在2700 4000 4400左右。求助啊

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-05-01 20:48:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体上；PCR片段2的时候，就在他两边加了酶切位点A-B，然后插进去连过片段1的载体上；PCR片段C的时候同理。。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2016-05-02 11:31:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-02 11:31:47
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体 ...

有人建议我试着直接往表达载体上连 不往克隆载体上连了。我还是感觉你的建议靠谱。谢谢啊

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-05-02 21:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
如果用无缝克隆的话，的确可以直接往目的载体上连。只不过多片段的连接效率就不得而知了。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-05-02 22:06:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用takara的gtl primestar 聚合酶一次p11k的没问题
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
5楼2016-05-02 22:57:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-02 11:31:47
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体 ...

pcr片段2一直无法插入pcr片段1后面是什么情况呢

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
6楼2016-05-03 14:01:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ppppppppp at 2016-05-02 22:57:56
用takara的gtl primestar 聚合酶一次p11k的没问题

我用的也是这一系列产品。是MAX保真性比你这个还高一些。就怕基因突变不好检测。MAX是23w9个的准确率。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-05-03 17:25:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

轩辕漪

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-05-04 00:22:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sloop112

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-05-05 10:33:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小狮子啦啦

新虫 (小有名气)
我之前连过一个两千片段和八千片段，用的infusion，效果还不错

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2016-05-05 19:50:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 leisure93 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 欢迎采矿、地质、岩土、计算机、人工智能等专业的同学报考 +3 pin8023 2026-02-28 5/250 2026-03-02 00:24 by 花YOU重开日
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[考研] 284求调剂 +8 天下熯 2026-02-28 8/400 2026-03-02 00:15 by 暮雨星晴
[考研] 材料学硕318求调剂 +11 February_Feb 2026-03-01 13/650 2026-03-01 23:53 by ccp273206157
[考研] 0856材料与化工，270求调剂 +6 YXCT 2026-03-01 6/300 2026-03-01 23:21 by 向上的胖东
[基金申请] 成果系统访问量大，请一小时后再尝试。---NSFC啥时候好哦，已经两天这样了 +4 NSFC2026我来了 2026-02-28 4/200 2026-03-01 22:37 by 铁门栓
[考研] 0856求调剂285 +10 吕仔龙 2026-02-28 10/500 2026-03-01 21:37 by 公瑾逍遥
[考研] 299求调剂 +3 Y墨明棋妙Y 2026-02-28 5/250 2026-03-01 21:01 by tangxiaotian
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 12/600 2026-03-01 19:48 by 好好好1233
[考研] 306分材料调剂 +4 chuanzhu川烛 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:48 by 无际的草原
[考研] 298求调剂 +6 axyz3 2026-02-28 6/300 2026-03-01 19:00 by 18137688336
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 化工专硕342，一志愿大连理工大学，求调剂 +3 kyf化工 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:49 by yywzz
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭