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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长bp的片段的连接问题。
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leisure93

新虫 (初入文坛)

[求助] 长bp的片段的连接问题。 已有3人参与

目的基因片段长度11kb左右。为了把他扩出来 分成了三段。part-1.2.3。part-1前段加入启动子。末端加了三个酶切位点。在part-2中加了几个内含子。part-3加了个荧光蛋白。现在part1.2.3都扩出来了，也验证过了，本来是想part-1.和part-2先连接后和part3连接。可是part1.2的连接一直不成功。导致实验没法继续进行，选用的是T-1载体。其中一些假阳性 连接时长 等问题都排除过了，也换过短的质粒 一直没能连接成功。重新加酶切位点也不太可能了，求助是不是长bp的片段链接应该需要注意什么？ part1.2.3的长度大约在2700 4000 4400左右。求助啊

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-05-01 20:48:37
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leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ppppppppp at 2016-05-02 22:57:56
用takara的gtl primestar 聚合酶一次p11k的没问题

我用的也是这一系列产品。是MAX保真性比你这个还高一些。就怕基因突变不好检测。MAX是23w9个的准确率。

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7楼2016-05-03 17:25:01
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体上；PCR片段2的时候，就在他两边加了酶切位点A-B，然后插进去连过片段1的载体上；PCR片段C的时候同理。。
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2楼2016-05-02 11:31:47
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leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-02 11:31:47
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体 ...

有人建议我试着直接往表达载体上连 不往克隆载体上连了。我还是感觉你的建议靠谱。谢谢啊

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3楼2016-05-02 21:49:15
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
如果用无缝克隆的话，的确可以直接往目的载体上连。只不过多片段的连接效率就不得而知了。

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4楼2016-05-02 22:06:22
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