应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 粘性末端连接时长问题
281/3返回列表123下一页
查看: 3585  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

成功源于想像

铜虫 (小有名气)

[求助] 粘性末端连接时长问题 已有5人参与

小弟最近在做载体构建，情况如下：
1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp；
2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp;
3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4；
4）T4连接10分钟（25度）。

结果：挑了六个克隆全为假阳性。
想请教的问题如下：
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
4）这个摩尔比是否合适？
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？

目前自己想尝试以下两个方法：
1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。
2）16度连接过夜试试。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-18 20:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时
4）这个摩尔比是否合适？
记得好像是1:1到1:3之间都可以
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？
我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。

如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-05-19 03:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meng_xu

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-24 17:54:57
1. 没有问题，20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟，20ul体系，1ul NEB T4（低浓度的），最近做的几个4+6kb的连接，都没有问题，如果你用的是超高浓度的，10分钟应该够了
4. 这个比例其实很让人纠结，反正我一般都是V:I=1:3吧
5. 可以在平板上标记记号，回头去平板拿不是很方便？另外，取菌落也不用全取，点一点点儿就够了啊
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2014-05-23 06:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

li569626694

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:41
1、以前做过克隆，酶切之后忘记做纯化处理，不知道你做了没有。
2、酶切片段用碱性磷酸酶处理一下，这样就不会有自连的。
3、片段/载体=1.0-1.3合适
4、室温连接过夜
5、菌落保存在甘油里面，然后放-80℃可以保存很长时间
6、你可以直接将菌落扩增以后，再用酶切，跑电泳就可以了
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-19 21:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:50
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-20 11:47:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-05-20 11:47:28
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？

同尾酶~
回复此楼
5楼2014-05-22 12:32:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-22 12:32:07
同尾酶~...

哦哦，想到了，不过没有去验证。谢谢。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-05-22 12:44:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mehongyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

亲，我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的，另外我想知道你买的T4是哪个公司的。
赞一下 回复此楼
7楼2014-05-22 14:05:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

notebox

新虫 (小有名气)
gyesang: 屏蔽内容, 请认真回答楼主问题，勿灌水！ 2014-05-25 23:00:20
本帖内容被屏蔽
8楼2014-05-22 16:11:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-22 14:05:22
亲，我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的，另外我想知道你买的T4是哪个公司的。

买的宝生物的，我挑到阳性克隆了，只挑到了一个，一百个里面挑到的！

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2014-05-24 00:21:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 成功源于想像 的主题更新
281/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 CyTWnZiM0cS6 2026-08-02 3/150 2026-08-02 20:44 by 3VGOm6paSgqv
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 CyTWnZiM0cS6 2026-08-02 5/250 2026-08-02 20:43 by 3VGOm6paSgqv
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 5/250 2026-08-02 20:31 by 3VGOm6paSgqv
[找工作] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 5/250 2026-08-02 20:31 by 3VGOm6paSgqv
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 9/450 2026-08-02 20:18 by 3VGOm6paSgqv
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 10/500 2026-08-02 20:12 by 3VGOm6paSgqv
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 13/650 2026-08-02 20:04 by 3VGOm6paSgqv
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 10/500 2026-08-02 20:03 by 3VGOm6paSgqv
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 17/850 2026-08-02 19:54 by 3VGOm6paSgqv
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 21/1050 2026-08-02 19:52 by 3VGOm6paSgqv
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 6/300 2026-08-02 18:34 by ca3DVAx4OB19
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 AS6fX1tr1on4 2026-08-02 8/400 2026-08-02 18:24 by ca3DVAx4OB19
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 20/1000 2026-08-02 18:04 by ca3DVAx4OB19
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cBGhfJFuNMca 2026-08-02 15/750 2026-08-02 16:23 by jHcrHMhbKCFV
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +18 低垂的野花 2026-07-31 24/1200 2026-08-02 16:03 by swallowwh
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 7/350 2026-08-02 07:59 by 88817753
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +11 winnerche 2026-07-29 15/750 2026-07-30 23:08 by jnhyjjm
[有机交流] 产物和副产物价值比较 30+4 小汤02 2026-07-27 5/250 2026-07-30 12:44 by czyzsu
[基金申请] 同事接到电话了，我却没有 +4 1234567wang 2026-07-27 4/200 2026-07-28 10:11 by GOODLUCKER
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭