应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 粘性末端连接时长问题
51/1返回列表
查看: 3165  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

成功源于想像

铜虫 (小有名气)

[求助] 粘性末端连接时长问题 已有5人参与

小弟最近在做载体构建，情况如下：
1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp；
2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp;
3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4；
4）T4连接10分钟（25度）。

结果：挑了六个克隆全为假阳性。
想请教的问题如下：
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
4）这个摩尔比是否合适？
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？

目前自己想尝试以下两个方法：
1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。
2）16度连接过夜试试。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-18 20:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

li569626694

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:41
1、以前做过克隆，酶切之后忘记做纯化处理，不知道你做了没有。
2、酶切片段用碱性磷酸酶处理一下，这样就不会有自连的。
3、片段/载体=1.0-1.3合适
4、室温连接过夜
5、菌落保存在甘油里面，然后放-80℃可以保存很长时间
6、你可以直接将菌落扩增以后，再用酶切，跑电泳就可以了
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-19 21:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 28 个回答

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时
4）这个摩尔比是否合适？
记得好像是1:1到1:3之间都可以
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？
我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。

如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-05-19 03:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:50
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-20 11:47:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-05-20 11:47:28
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？

同尾酶~
回复此楼
5楼2014-05-22 12:32:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 28 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕306英一数二 +8 z1z2z3879 2026-03-16 10/500 2026-03-18 00:01 by 星空星月
[基金申请] 被我言中：新模板不强调格式了，假专家开始管格式了 +4 beefly 2026-03-14 4/200 2026-03-17 22:04 by 黄鸟于飞Chao
[考研] 303求调剂 +3 睿08 2026-03-17 5/250 2026-03-17 22:01 by 睿08
[考研] 085601专硕，总分342求调剂，地区不限 +4 share_joy 2026-03-16 4/200 2026-03-17 21:32 by hmn_wj
[考研] 材料与化工求调剂 +6 为学666 2026-03-16 6/300 2026-03-17 20:15 by peike
[考研] 070300化学319求调剂 +4 锦鲤0909 2026-03-17 4/200 2026-03-17 18:21 by 重科小霸王
[考研] 301求调剂 +4 A_JiXing 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:32 by ruiyingmiao
[考研] 271求调剂 +12 生如夏花… 2026-03-11 14/700 2026-03-17 10:56 by lovewei0727
[硕博家园] 深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿） +4 xujiaoszu 2026-03-11 9/450 2026-03-17 10:29 by xujiaoszu
[考研] 285化工学硕求调剂（081700） +9 柴郡猫_ 2026-03-12 9/450 2026-03-17 10:18 by Sammy2
[考研] 283求调剂 +3 听风就是雨； 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:41 by 热情沙漠
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭