| 查看: 3207 | 回复: 27 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
粘性末端连接时长问题 已有5人参与
|
||
|
小弟最近在做载体构建，情况如下： 1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp； 2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp; 3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4； 4）T4连接10分钟（25度）。 结果：挑了六个克隆全为假阳性。 想请教的问题如下： 1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 4）这个摩尔比是否合适？ 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 目前自己想尝试以下两个方法： 1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。 2）16度连接过夜试试。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有282人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于双酶切的酶的失活问题
已经有6人回复
- BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
已经有11人回复
- 请问这个物质中Al和O是怎么连接的？
已经有4人回复
- PCR割胶纯化问题
已经有4人回复
- 将目的基因连入表达质粒，酶切位点问题
已经有3人回复
- PCR产物平末端化问题
已经有5人回复
- 2.7Kb的片段连接问题
已经有6人回复
- 酶切后的补平连接
已经有9人回复
- 平末端连接不上，求助
已经有21人回复
- 关于平末端连接
已经有14人回复
- 双酶切之后，线状质粒的连接问题
已经有13人回复
- 一个平末端和粘性末端怎样连接比较好
已经有8人回复
- 我构建质粒后酶切验证的问题
已经有13人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 虚心请教关于平—粘末端的连接问题
已经有18人回复
- 法兰连接垫片蠕变的ANSYS模拟
已经有10人回复
- DNA片段经过酶切后的粘性末端怎么磨平？
已经有15人回复
- DNA的连接反应
已经有5人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平
已经有4人回复
- 求助！请问 NdeI 和EcoRI 同时做酶切可以吗？
已经有3人回复
- 【求助/交流】求平末端的连接体系！
已经有5人回复
- 【求助/交流】DNA片段连接的温度和反应条件
已经有7人回复
- 【求助/交流】粘性末端连接问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】平末端必须去磷酸化吗
已经有6人回复
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-05-20 11:47:28
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
|
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 应该没有任何问题。 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 50-90s应该都可以，我都试过 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时 4）这个摩尔比是否合适？ 记得好像是1:1到1:3之间都可以 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。 如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的 |
2楼2014-05-19 03:03:01
li569626694
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 92.1
- 帖子: 19
- 在线: 2.8小时
- 虫号: 1717913
- 注册: 2012-03-26
- 性别: GG
- 专业: 化学生物学与生物有机化学
3楼2014-05-19 21:40:04
5楼2014-05-22 12:32:07
