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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 粘性末端连接时长问题
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

[求助] 粘性末端连接时长问题 已有5人参与

小弟最近在做载体构建，情况如下：
1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp；
2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp;
3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4；
4）T4连接10分钟（25度）。

结果：挑了六个克隆全为假阳性。
想请教的问题如下：
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
4）这个摩尔比是否合适？
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？

目前自己想尝试以下两个方法：
1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。
2）16度连接过夜试试。
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1楼 2014-05-18 20:18:18
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-05-20 11:47:28
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？

同尾酶~
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5楼2014-05-22 12:32:07
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铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-22 14:05:22
亲，我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的，另外我想知道你买的T4是哪个公司的。

买的宝生物的，我挑到阳性克隆了，只挑到了一个，一百个里面挑到的！

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-05-24 00:21:10
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铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-24 10:04:00
片段浓度是否定量
...

有定量啊，不定量怎么算摩尔比呢？您说是吧？
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12楼2014-05-24 11:56:40
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铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-19 03:03:01
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明 ...

“我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。”这个方法不错，我会考虑以后也这么做！
整个实验，我后来分析，虽然是双酶切，并且做了单酶对照，而且Gel检测酶切效果都很好，但是还是有很少量的没有酶切到，或者说只发生单酶切的产物，而成功连接的片段又很大10k, 因此在转化时，这个片段小的自连产物和没有酶切的产物更容易进入到E.coli之中，因此假阳性很多。

这次算是成功了，从100个里挑出了一个阳性克隆，而且连接方向也是对。

但是下次做的时候，1）要适当考虑增加连接时间，2）适当缩小片段。
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13楼2014-05-24 12:03:03
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铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-22 14:05:22
亲，我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的，另外我想知道你买的T4是哪个公司的。

恩，以后我会增加连接时间，T4是用的全式金的！！有一楼层我说是宝生物的，哎，说错了，是全式金的~~~~
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14楼2014-05-24 12:07:41
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铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-23 06:16:10
1. 没有问题，20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟，20ul体系，1ul NEB T4（低浓度的），最近做的几个4+6kb的连接，都没有问题，如果你用的是超高浓度的，10分钟应该够了
4. 这个比例其 ...

“1. 没有问题，20k的我也转过”
之前做了二个6+2K的，很顺利，阳性率接近100%，这次10k, 我以为算大的了呢~

“2. 个人一般做60s”
你做的时候，用的什么管子呢？据说这个管子的厚薄对转化是有影响的，管子薄的话导热更快~

3，俺可以试试，谢谢楼主~

5. 平板上标记记号，这个主意也不错，刚开始我觉得挺难标的，后来想了想，是可以在平板背面做标记的，这样就方便多了，是这样吗？这个主意不错，谢谢楼主~~
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15楼2014-05-24 12:13:19
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铜虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:34:11
100挑一个，好吧，楼主你真幸运。一般双酶切不会有问题的，你可以考虑用下NEB的酶。理论上来说粘端嘛，应该只有阳性克隆，你得效率实在太低了，做一个克隆还好，你要是做很多的克隆那还不累死了。...

恩，这次是运气好，接下来的两个载体肯定不能这么做了~~
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24楼2014-05-25 14:43:15
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铜虫 (小有名气)
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21楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-25 02:39:45
就是普通的1.5ml管，我用水浴，没什么问题。

对于连接的转化，如果要是室温连接，那么你的感受态最好效率高些。

平板上标记不是很常用的操作么？你挑选克隆的时候，圈上，标记，然后回头找的时候知道哪个菌落 ...

哈哈，我以前都是直接挑，摇菌，然后检测，所以没标记过~现在想早点知道结果，才想到了先检测然后才摇菌~
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25楼2014-05-25 14:45:18
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