应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 粘性末端连接时长问题
51/1返回列表
查看: 3641  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

成功源于想像

铜虫 (小有名气)

[求助] 粘性末端连接时长问题 已有5人参与

小弟最近在做载体构建，情况如下：
1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp；
2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp;
3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4；
4）T4连接10分钟（25度）。

结果：挑了六个克隆全为假阳性。
想请教的问题如下：
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
4）这个摩尔比是否合适？
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？

目前自己想尝试以下两个方法：
1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。
2）16度连接过夜试试。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-18 20:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

meng_xu

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-24 17:54:57
1. 没有问题，20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟，20ul体系，1ul NEB T4（低浓度的），最近做的几个4+6kb的连接，都没有问题，如果你用的是超高浓度的，10分钟应该够了
4. 这个比例其实很让人纠结，反正我一般都是V:I=1:3吧
5. 可以在平板上标记记号，回头去平板拿不是很方便？另外，取菌落也不用全取，点一点点儿就够了啊
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2014-05-23 06:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 28 个回答

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时
4）这个摩尔比是否合适？
记得好像是1:1到1:3之间都可以
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？
我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。

如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-05-19 03:03:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

li569626694

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:41
1、以前做过克隆，酶切之后忘记做纯化处理，不知道你做了没有。
2、酶切片段用碱性磷酸酶处理一下，这样就不会有自连的。
3、片段/载体=1.0-1.3合适
4、室温连接过夜
5、菌落保存在甘油里面，然后放-80℃可以保存很长时间
6、你可以直接将菌落扩增以后，再用酶切，跑电泳就可以了
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-19 21:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
成功源于想像(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:27:50
载体pGL3，MluI/BglII两酶切
片段：BssHII/BamHI双酶切
两个的酶用的都不一样    能做出来？
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-20 11:47:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 28 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 什么时候开奖？ +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 炎黄贵胄 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭