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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

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[求助] 粘性末端连接时长问题已有5人参与

小弟最近在做载体构建，情况如下：
1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp；
2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp;
3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4；
4）T4连接10分钟（25度）。

结果：挑了六个克隆全为假阳性。
想请教的问题如下：
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
4）这个摩尔比是否合适？
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？

目前自己想尝试以下两个方法：
1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。
2）16度连接过夜试试。

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1楼2014-05-18 20:18:18

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meng_xu

铜虫 (小有名气)

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★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-24 17:54:57

1. 没有问题，20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟，20ul体系，1ul NEB T4（低浓度的），最近做的几个4+6kb的连接，都没有问题，如果你用的是超高浓度的，10分钟应该够了
4. 这个比例其实很让人纠结，反正我一般都是V:I=1:3吧
5. 可以在平板上标记记号，回头去平板拿不是很方便？另外，取菌落也不用全取，点一点点儿就够了啊

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9楼2014-05-23 06:16:10

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DAX1

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46

1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？
没链接过10分钟的，我一般室温放置一个小时
4）这个摩尔比是否合适？
记得好像是1:1到1:3之间都可以
5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？
我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。

如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的

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2楼2014-05-19 03:03:01

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