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粘性末端连接时长问题 已有5人参与
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小弟最近在做载体构建，情况如下： 1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp； 2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp; 3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4； 4）T4连接10分钟（25度）。 结果：挑了六个克隆全为假阳性。 想请教的问题如下： 1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 4）这个摩尔比是否合适？ 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 目前自己想尝试以下两个方法： 1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。 2）16度连接过夜试试。 |
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