15楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 12:13:19
“1. 没有问题，20k的我也转过”
之前做了二个6+2K的，很顺利，阳性率接近100%，这次10k, 我以为算大的了呢~

“2. 个人一般做60s”
你做的时候，用的什么管子呢？据说这个管子的厚薄对转化是有影响的，管子薄 ...

19楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-05-24 17:45:21
嗯，我们实验室都是用的Takara的酶，我的是PAS2 载体，基因1700bp,用的spe1和nde两个酶，37°切三个小时，酶切后跑胶，和空载体比较是切开了（但是切完全没有我也就不知道了），酶连转化能长出来菌，但是挑了60/70 ...

22楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-25 03:15:41
你要是担心酶切不完全，可以多切几个小时，我一般处理载体都会酶切6-8个小时。和你所说的一样，你看不出来单酶切或者双酶切的区别（除非两个酶切位点之间的序列超过一定长度）。不知道你连接时候做了自连对照没有？ ...

18楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:34:11
100挑一个，好吧，楼主你真幸运。一般双酶切不会有问题的，你可以考虑用下NEB的酶。理论上来说粘端嘛，应该只有阳性克隆，你得效率实在太低了，做一个克隆还好，你要是做很多的克隆那还不累死了。...

21楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-25 02:39:45
就是普通的1.5ml管，我用水浴，没什么问题。

对于连接的转化，如果要是室温连接，那么你的感受态最好效率高些。

平板上标记不是很常用的操作么？你挑选克隆的时候，圈上，标记，然后回头找的时候知道哪个菌落 ...

23楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-05-25 08:20:39
自连对照应该就是就是只切载体，然后连接做转化，如果能够长出来菌就说明酶切没有完全？是这样子吗？
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