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粘性末端连接时长问题 已有5人参与
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小弟最近在做载体构建，情况如下： 1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp； 2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp; 3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4； 4）T4连接10分钟（25度）。 结果：挑了六个克隆全为假阳性。 想请教的问题如下： 1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 4）这个摩尔比是否合适？ 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 目前自己想尝试以下两个方法： 1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。 2）16度连接过夜试试。 |
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你要是担心酶切不完全，可以多切几个小时，我一般处理载体都会酶切6-8个小时。和你所说的一样，你看不出来单酶切或者双酶切的区别（除非两个酶切位点之间的序列超过一定长度）。不知道你连接时候做了自连对照没有？就是将片段换成水，如果你的自连和你的片段连接都差不多的话，那证明你的酶切是有问题的。至于连接体系比列，和我上面说的那样，摩尔比1:1到1:3之间都可以，你可以Google下怎么计算，况且粘端的话，一般情况随便多少都可以连进去的。至于你的载体能否蓝白筛选，你得看你得载体信息啊，你们买载体时应该有protocol吧。其实蓝白筛选也没多大得意义。因为你效率高得情况下，基本都没有蓝斑，而且白斑也不都是阳性。 |
22楼2014-05-25 03:15:41
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
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1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 应该没有任何问题。 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 50-90s应该都可以，我都试过 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时 4）这个摩尔比是否合适？ 记得好像是1:1到1:3之间都可以 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。 如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的 |
2楼2014-05-19 03:03:01
li569626694
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3楼2014-05-19 21:40:04
鬼羽帝魂
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4楼2014-05-20 11:47:28
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