【答案】应助回帖

10楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 00:21:10
买的宝生物的，我挑到阳性克隆了，只挑到了一个，一百个里面挑到的！
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11楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-24 10:04:00
片段浓度是否定量
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2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-19 03:03:01
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明 ...

7楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-22 14:05:22
亲，我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的，另外我想知道你买的T4是哪个公司的。

9楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-23 06:16:10
1. 没有问题，20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟，20ul体系，1ul NEB T4（低浓度的），最近做的几个4+6kb的连接，都没有问题，如果你用的是超高浓度的，10分钟应该够了
4. 这个比例其 ...

2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-19 03:03:01
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？
应该没有任何问题。
2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？
50-90s应该都可以，我都试过
3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明 ...

16楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-05-24 16:26:09
你好，你说的假阳性多可能是酶切不完全，那怎样检测酶切完全了呢？另外，说到去磷具体是怎么操作的？最近也是在构载体，有一个载体也是转化能转出来菌，但是菌落PCR挑不出阳性的，很苦恼，求指点
...

13楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 12:03:03
“我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。”这个方法不错，我会考虑以后也这么做！
整个实验，我后来分析，虽然是双酶切，并且做了单酶对照，而且 ...

17楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:32:10
首先，可以和楼主的方法相似，你可以分别单酶切看酶切效率。一般来讲除非是两种酶在一种buffer中的酶切效率差很多才会出现双酶切不完全，因为酶的量基本都是过量的。如果你担心双酶切效率不高，你可以先用一个酶酶 ...

17楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:32:10
首先，可以和楼主的方法相似，你可以分别单酶切看酶切效率。一般来讲除非是两种酶在一种buffer中的酶切效率差很多才会出现双酶切不完全，因为酶的量基本都是过量的。如果你担心双酶切效率不高，你可以先用一个酶酶 ...