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mehongyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 00:21:10
买的宝生物的,我挑到阳性克隆了,只挑到了一个,一百个里面挑到的!
...

片段浓度是否定量

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11楼2014-05-24 10:04:00
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-24 10:04:00
片段浓度是否定量
...

有定量啊,不定量怎么算摩尔比呢?您说是吧?
12楼2014-05-24 11:56:40
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-19 03:03:01
1)如果连接成功,片段大小近10K,这么大的片段转化(热激法)是不是有难度?
应该没有任何问题。
2)一般来说热激法42度多少秒比较合适?
50-90s应该都可以,我都试过
3)载体和片段都是粘性末端,所以按照说明 ...

“我一般都是挑个克隆,在一个新板子上划个线,然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。”这个方法不错,我会考虑以后也这么做!
整个实验,我后来分析,虽然是双酶切,并且做了单酶对照,而且Gel检测酶切效果都很好,但是还是有很少量的没有酶切到,或者说只发生单酶切的产物,而成功连接的片段又很大10k, 因此在转化时,这个片段小的自连产物和没有酶切的产物更容易进入到E.coli之中,因此假阳性很多。

这次算是成功了,从100个里挑出了一个阳性克隆,而且连接方向也是对。

但是下次做的时候,1)要适当考虑增加连接时间,2)适当缩小片段。
13楼2014-05-24 12:03:03
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by mehongyu at 2014-05-22 14:05:22
亲,我们一般没你这么长的片段都要过夜连接的,另外我想知道你买的T4是哪个公司的。

恩,以后我会增加连接时间,T4是用的全式金的!!有一楼层我说是宝生物的,哎,说错了,是全式金的~~~~
14楼2014-05-24 12:07:41
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-23 06:16:10
1. 没有问题,20k的我也转过
2. 个人一般做60s
3. 我一般做连接是22度30分钟,20ul体系,1ul NEB T4(低浓度的),最近做的几个4+6kb的连接,都没有问题,如果你用的是超高浓度的,10分钟应该够了
4. 这个比例其 ...

“1. 没有问题,20k的我也转过”
之前做了二个6+2K的,很顺利,阳性率接近100%,这次10k, 我以为算大的了呢~

“2. 个人一般做60s”
你做的时候,用的什么管子呢?据说这个管子的厚薄对转化是有影响的,管子薄的话导热更快~

3,俺可以试试,谢谢楼主~

5. 平板上标记记号,这个主意也不错,刚开始我觉得挺难标的,后来想了想,是可以在平板背面做标记的,这样就方便多了,是这样吗?这个主意不错,谢谢楼主~~
15楼2014-05-24 12:13:19
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-19 03:03:01
1)如果连接成功,片段大小近10K,这么大的片段转化(热激法)是不是有难度?
应该没有任何问题。
2)一般来说热激法42度多少秒比较合适?
50-90s应该都可以,我都试过
3)载体和片段都是粘性末端,所以按照说明 ...

你好,你说的假阳性多可能是酶切不完全,那怎样检测酶切完全了呢?另外,说到去磷具体是怎么操作的?最近也是在构载体,有一个载体也是转化能转出来菌,但是菌落PCR挑不出阳性的,很苦恼,求指点

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天道酬勤
16楼2014-05-24 16:26:09
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DAX1

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-24 22:58:31
引用回帖:
16楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-05-24 16:26:09
你好,你说的假阳性多可能是酶切不完全,那怎样检测酶切完全了呢?另外,说到去磷具体是怎么操作的?最近也是在构载体,有一个载体也是转化能转出来菌,但是菌落PCR挑不出阳性的,很苦恼,求指点
...

首先,可以和楼主的方法相似,你可以分别单酶切看酶切效率。一般来讲除非是两种酶在一种buffer中的酶切效率差很多才会出现双酶切不完全,因为酶的量基本都是过量的。如果你担心双酶切效率不高,你可以先用一个酶酶切后回首再用另一个酶切。其次,建议做载体克隆时买NEB的酶。

第二个问题,酶切产物是带有磷的,在有些情况下,虽然载体双酶切产生的粘端不是很匹配。在有磷的情况的下,还是可以发生自连的。因为你的产物经过酶切后会产生磷,所以不用担心连接不上(假如你是平端克隆,那你的载体就必须去磷,然后片段必须加磷)。去磷有专门的去磷酶,比如CIP,你可以到NEB的目录去看一看
17楼2014-05-24 17:32:10
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DAX1

新虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 12:03:03
“我一般都是挑个克隆,在一个新板子上划个线,然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。”这个方法不错,我会考虑以后也这么做!
整个实验,我后来分析,虽然是双酶切,并且做了单酶对照,而且 ...

100挑一个,好吧,楼主你真幸运。一般双酶切不会有问题的,你可以考虑用下NEB的酶。理论上来说粘端嘛,应该只有阳性克隆,你得效率实在太低了,做一个克隆还好,你要是做很多的克隆那还不累死了。
18楼2014-05-24 17:34:11
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:32:10
首先,可以和楼主的方法相似,你可以分别单酶切看酶切效率。一般来讲除非是两种酶在一种buffer中的酶切效率差很多才会出现双酶切不完全,因为酶的量基本都是过量的。如果你担心双酶切效率不高,你可以先用一个酶酶 ...

嗯,我们实验室都是用的Takara的酶,我的是PAS2 载体,基因1700bp,用的spe1和nde两个酶,37°切三个小时,酶切后跑胶,和空载体比较是切开了(但是切完全没有我也就不知道了),酶连转化能长出来菌,但是挑了60/70个菌都找不到阳性的。还想请教一下你们酶连体系怎么弄的。我们实验室有nanodrop,但是测验浓度后我还不是会转换成体积的比例,还想请教一下酶连这一块?另外,我的PAS2 可以用蓝白斑和抗生素同时筛选吗?

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天道酬勤
19楼2014-05-24 17:45:21
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:32:10
首先,可以和楼主的方法相似,你可以分别单酶切看酶切效率。一般来讲除非是两种酶在一种buffer中的酶切效率差很多才会出现双酶切不完全,因为酶的量基本都是过量的。如果你担心双酶切效率不高,你可以先用一个酶酶 ...

对了,还有,我们实验室连接用的是Takara的solution1,16过夜连接

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天道酬勤
20楼2014-05-24 17:46:48
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