| 查看: 3643 | 回复: 27 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
粘性末端连接时长问题 已有5人参与
|
||
|
小弟最近在做载体构建，情况如下： 1）载体pGL3，MluI/BglII两酶切，大小为4818bp； 2）片段：BssHII/BamHI双酶切，大小为4923bp; 3）连接摩尔比为：载体/片段=1/4； 4）T4连接10分钟（25度）。 结果：挑了六个克隆全为假阳性。 想请教的问题如下： 1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 4）这个摩尔比是否合适？ 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 目前自己想尝试以下两个方法： 1）继续挑克隆，说不定能挑到阳性的。 2）16度连接过夜试试。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有72人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
随风飘摇11
木虫 (著名写手)
- 应助: 92 (初中生)
- 金币: 2284.9
- 散金: 606
- 红花: 53
- 帖子: 2249
- 在线: 818.5小时
- 虫号: 1146270
- 注册: 2010-11-14
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
20楼2014-05-24 17:46:48
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-19 08:28:46
|
1）如果连接成功，片段大小近10K，这么大的片段转化（热激法）是不是有难度？ 应该没有任何问题。 2）一般来说热激法42度多少秒比较合适？ 50-90s应该都可以，我都试过 3）载体和片段都是粘性末端，所以按照说明书操作，T4连接仅用了10分钟（25度），时间是不是短了？ 没链接过10分钟的， 我一般室温放置一个小时 4）这个摩尔比是否合适？ 记得好像是1:1到1:3之间都可以 5）挑克隆时按如下操作不知可否：挑克隆于10ul蒸馏水中，混匀取1ul做PCR模板，PCR结果若为阳性，把剩下的9ul用于扩培，不知道这个菌落置于蒸馏水中能存活多长时间？ 我一般都是挑个克隆，在一个新板子上划个线，然后将挑克隆的牙签或者枪头放到pcr反应里面搅拌一下就可以。 如果你有那么多的假阳性，是否考虑载体酶切不完全，一般粘端没那么多假阳性的。或者你可以将酶切的载体去磷处理下，基本上不会出现自连情况的 |
2楼2014-05-19 03:03:01
li569626694
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 92.1
- 帖子: 19
- 在线: 2.8小时
- 虫号: 1717913
- 注册: 2012-03-26
- 性别: GG
- 专业: 化学生物学与生物有机化学
3楼2014-05-19 21:40:04
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-05-20 11:47:28
28