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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建全长cDNA中连接的问题
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] 构建全长cDNA中连接的问题

各位朋友：
   我现在要构建全长的cDNA，全长是15186bp，分为12个目的片段。分别连在T载体上了。设计了一系列的酶切连接方案，要连到 PMC18 质粒上，这是一个低拷贝的质粒。现今T载体上和PMC18 上各连了3个目的片段，另外一个PMC18 连接了2个目的片段，可之后的连接之路依旧很艰难。请求朋友们给点好的连接方法，想法。多谢！
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blackrose8089

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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-07-09 11:34:23
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
帮顶！很活跃的小虫，继续努力哦！

3.1新虫
考虑到对新虫的鼓励和照顾，当前金币小于50，或者注册日期不超过1个月的虫友列为新虫。其他均不在新虫照顾之列。对新虫的处罚从轻，奖励从重。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2994095
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2楼2011-07-09 12:24:23
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-09 12:24:23:
帮顶！很活跃的小虫，继续努力哦！

3.1新虫
考虑到对新虫的鼓励和照顾，当前金币小于50，或者注册日期不超过1个月的虫友列为新虫。其他均不在新虫照顾之列。对新虫的处罚从轻，奖励从重。

[url]h ...

我还是新虫啊，我都是铜虫了哇。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-07-09 14:21:52
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
青菜小虫(金币+2): 我就是这么做的啊，我现在有3个同步的质粒，顺序就是1234,7896,101112分别连。我的困惑是现在目的片段往每一个质粒上连接都很艰难，连不上了。 2011-07-09 16:08:16
dhd997(金币+2): good 2011-07-09 18:17:38
青菜小虫(金币+1): 谢谢帮助。 2011-07-11 14:15:50
西瓜(金币+2): Good!补上EPI！ 2011-07-13 22:52:38
西瓜(EPI+1): 连楼下一起 2011-07-15 17:46:13
把12个片段尽量按顺序分成3-4组同时去连载体，如果酶切位点设计的足够合理的话不按顺序也没什么问题。等这3-4个都验证正确后再互连。
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4楼2011-07-09 15:52:53
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
要我继续解答的话，你得先给我消除这两个疑问。不知道你分段得序号是不是跟序列顺序一致，如果一致的话问题是，1：你的第5个片段哪去了？2：能解释一下你为什么要把第6个片段放到9号片段后面吗？
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5楼2011-07-14 17:13:03
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-14 17:13:03:
要我继续解答的话，你得先给我消除这两个疑问。不知道你分段得序号是不是跟序列顺序一致，如果一致的话问题是，1：你的第5个片段哪去了？2：能解释一下你为什么要把第6个片段放到9号片段后面吗？

好吧，我只是大体上给你说了一下我的连接方案。因为目的片段都是一段一段连到载体上的啊，我只是给你说了一个顺序而已，89片段连接之后，因为7是反向连到T载体上的，所以连7的时候，7连到89的上方，正好顺序是789，然后我在6片段的上游加了一个酶切位点，把6再连接到T载体上7的上游，这不顺序没变，还是6789的吗？连接方案我都设计好了，所以片段的顺序都不会乱。我唯一感觉困难的就是6在往含T-789载体上连接就很难。这也就是求助的原因，怎么连上去？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
6楼2011-07-14 17:30:44
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
可以看出你做分子克隆功底还是很深的，既然6连789连不上去第一直觉就是问题可能出现在片段和载体酶切上，比如你选用的什么酶，酶切是不是彻底之类的
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7楼2011-07-15 10:56:59
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
很艰巨的任务！
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青菜小虫
jiayoubashaonian
8楼2011-08-28 15:30:26
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-28 15:30:26:
很艰巨的任务！

怎么今天把我发的帖子都看了一遍？辛苦你了
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
9楼2011-08-28 15:56:37
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
西瓜: 小虫开讲要来捧场啊，哈哈哈 2011-08-28 16:51:22
引用回帖:
9楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-08-28 15:56:37:
怎么今天把我发的帖子都看了一遍？辛苦你了

去分子生物学论坛看了一下，小虫要讲文献了，随后看了一下小虫的帖子，发现能解答一些，索性全部看了一遍！
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jiayoubashaonian
10楼2011-08-28 15:58:25
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