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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建全长cDNA中连接的问题
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] 构建全长cDNA中连接的问题

各位朋友：
   我现在要构建全长的cDNA，全长是15186bp，分为12个目的片段。分别连在T载体上了。设计了一系列的酶切连接方案，要连到 PMC18 质粒上，这是一个低拷贝的质粒。现今T载体上和PMC18 上各连了3个目的片段，另外一个PMC18 连接了2个目的片段，可之后的连接之路依旧很艰难。请求朋友们给点好的连接方法，想法。多谢！
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blackrose8089

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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-07-09 11:34:23
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-09 12:24:23:
帮顶！很活跃的小虫，继续努力哦！

3.1新虫
考虑到对新虫的鼓励和照顾，当前金币小于50，或者注册日期不超过1个月的虫友列为新虫。其他均不在新虫照顾之列。对新虫的处罚从轻，奖励从重。

[url]h ...

我还是新虫啊，我都是铜虫了哇。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-07-09 14:21:52
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-07-14 17:13:03:
要我继续解答的话，你得先给我消除这两个疑问。不知道你分段得序号是不是跟序列顺序一致，如果一致的话问题是，1：你的第5个片段哪去了？2：能解释一下你为什么要把第6个片段放到9号片段后面吗？

好吧，我只是大体上给你说了一下我的连接方案。因为目的片段都是一段一段连到载体上的啊，我只是给你说了一个顺序而已，89片段连接之后，因为7是反向连到T载体上的，所以连7的时候，7连到89的上方，正好顺序是789，然后我在6片段的上游加了一个酶切位点，把6再连接到T载体上7的上游，这不顺序没变，还是6789的吗？连接方案我都设计好了，所以片段的顺序都不会乱。我唯一感觉困难的就是6在往含T-789载体上连接就很难。这也就是求助的原因，怎么连上去？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
6楼2011-07-14 17:30:44
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

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8楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-28 15:30:26:
很艰巨的任务！

怎么今天把我发的帖子都看了一遍？辛苦你了
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
9楼2011-08-28 15:56:37
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青菜小虫

银虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-28 15:58:25:
去分子生物学论坛看了一下，小虫要讲文献了，随后看了一下小虫的帖子，发现能解答一些，索性全部看了一遍！

11楼2011-08-28 16:00:13
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