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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于建立cDNA文库的诸多问题，拜请解答
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sai00fuji

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于建立cDNA文库的诸多问题，拜请解答

1、clontech的smarter kit大家有米有用过？效果怎样？
   invitrogen的有用过的米？多少钱买的？效果捏?
2、质粒文库跟酵母文库差别大吗？我想筛est，然后做表达。
3、clontech的技术客服说起始不用mRNA也可以，用总RNA就行，还声称10ng总RNA就可以。大家觉得靠谱吗？
4、关于mRNA质量的验证，说是有smear，smear是什么样子的？能否提供图片，实在不行文字说明，举例子，打比方都行。
5、载体选择上有没有什么讲究？


To check quality, analyze 100 ng of your mRNA using a Bioanalyzer, or by
performing agarose gel electrophoresis using a 1% E-Gel® EX Gel (see page 45 for ordering information). Your mRNA will appear as a smear, with the greatest intensity in the range of 1 to 3 kb. Some rRNA bands may still be faintly visible. If you do not detect a smear, or if the majority of the smear is significantly lessthan 1 kb, you will need to repeat the RNA isolation. Be sure to follow the recommendations listed on the previous page to prevent RNase contamination.


这里关于mRNA电泳的描述，我能否认为smear是弥散的条带。。。。



谢谢各位啦！！
鞠躬！！

[ Last edited by sai00fuji on 2011-2-26 at 20:42 ]
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1楼 2011-02-25 19:18:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
翱宇(金币+1): 谢谢交流 2011-02-25 21:32:05
sai00fuji(金币+8): 谢谢 2011-02-25 22:04:23
1, 这些试剂盒价格都不菲，我没有用过。见过视频上用过Cosmid or Fosmid eDNA library Kit，感觉不错。

4,可以给你提供一个smear 的图片：

5,做文库时候载体要高效，比如连接效率，转化效率；另外还有满足容纳片段的大小要求。
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2楼2011-02-25 21:31:38
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路人甲007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 鼓励参与交流 2011-02-26 09:05:29
sai00fuji(金币+12): 2011-02-26 17:15:37
1.用过clontech的不错，invitrogen的没有用过，不敢评价，不过invitrogen也是大牌子，具体选择什么试剂盒还是楼主你比较一下两个试剂盒的说明书最好
2.通常的文库都是测序用的，除非特殊的试剂盒，例如酵母双杂交文库试剂盒。我看你的目的应该就是构建一个普通的cDNA文库，然后测序，然后选择目的的基因酵母表达吧。
3.clontech的SMART就是直接用的总RNA，你看一下说明书就知道了，不用纯化mRNA的
4.smear说的是双链cDNA，类似于沙发发的图，好的双链图谱是smear+几条特征带，因样品不同而异
5.不知道你说的什么载体，是构建文库的载体吗，每一种试剂盒都有固定的载体。一般选择质粒的载体吧
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4楼2011-02-25 22:51:39
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
silicare(金币+3): 这个网站very good！ 2011-02-26 12:00:10
sai00fuji(金币+2): 非常赞的网站~ 2011-02-26 17:35:37
内容已删除
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5楼2011-02-26 10:50:34
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-25 21:31:38:
1, 这些试剂盒价格都不菲，我没有用过。见过视频上用过Cosmid or Fosmid eDNA library Kit，感觉不错。

4,可以给你提供一个smear 的图片：

5,做文库时候载体要 ...

请问是什么视频啊？哪家公司的？
这两个都是smear吗？mRNA纯化的好是这样吗？
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3楼2011-02-25 22:05:44
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 路人甲007 at 2011-02-25 22:51:39:
1.用过clontech的不错，invitrogen的没有用过，不敢评价，不过invitrogen也是大牌子，具体选择什么试剂盒还是楼主你比较一下两个试剂盒的说明书最好
2.通常的文库都是测序用的，除非特殊的试剂盒，例如酵母双杂交 ...

再具体问一下，clontech的kit，起始需要总RNA大约多少？全长率能达到多少？


To check quality, analyze 100 ng of your mRNA using a Bioanalyzer, or by
performing agarose gel electrophoresis using a 1% E-Gel® EX Gel (see page 45 for ordering information). Your mRNA will appear as a smear, with the greatest intensity in the range of 1 to 3 kb. Some rRNA bands may still be faintly visible. If you do not detect a smear, or if the majority of the smear is significantly lessthan 1 kb, you will need to repeat the RNA isolation. Be sure to follow the recommendations listed on the previous page to prevent RNase contamination.


这里关于mRNA电泳的描述，我能否认为smear是弥散的条带。。。。
谢谢~
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6楼2011-02-26 17:33:53
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路人甲007

木虫 (正式写手)
我没有纯化过mRNA，我都是用总RNA直接做的，
RNA样品也跑胶，我主要是看18S和28SRNA条带 通过跑全RNA看是否降解的
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7楼2011-02-26 19:49:38
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 路人甲007 at 2011-02-26 19:49:38:
我没有纯化过mRNA，我都是用总RNA直接做的，
RNA样品也跑胶，我主要是看18S和28SRNA条带 通过跑全RNA看是否降解的

那个rna有没有必要测od值呀
量要多大？
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8楼2011-02-26 20:44:35
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路人甲007

木虫 (正式写手)
sai00fuji(金币+3): 谢谢 2011-02-27 12:35:59
要测的，OD260/280  1.8-2.0
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9楼2011-02-26 20:48:44
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myggxh

新虫 (正式写手)
学习了，呵呵。
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10楼2011-12-21 11:38:34
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hyphen007

金虫 (小有名气)
这个不错，要顶的
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11楼2013-07-10 20:26:48
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hyphen007

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 路人甲007 at 2011-02-26 20:48:44
要测的，OD260/280  1.8-2.0

OD260/280 一般应该2.0？小了说明污染严重，大了说明降解严重，是这样吗？

[ Last edited by hyphen007 on 2013-7-14 at 09:01 ]
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12楼2013-07-10 20:28:05
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