| 查看: 2337 | 回复: 2 | ||
[求助]
【求助】PGL3-basic载体，连500bp左右的片段，菌落长得很满，却都是空载体 已有1人参与
|
|
这个做了两次，第一次：质粒跟目的片段酶切都是37度过夜的，质粒也切开了（4800bp处条带），连接是4度过夜连的（所用T4的说明书上是4度）。转化amp板子之后第二天密密麻麻都是菌落，但是提出来的质粒双切之后只能看到载体条带，500bp处空空如也，但奇怪的是PCR却能P出500bp条带来。 不死心，拿去测序，果然转进去的是空质粒。 理论上感受态细胞只能接受一种质粒啊，所以又否决了重组和空载都转进去了的猜测。 第二次P完之后先拿去测序，无误，其他步骤同上，不过多连接了半天，结果还是一样，这次连PCR都没条带了。 但还是能长出密密麻麻的菌落，然后提出来发现是空质粒。 排查各种情况后，俺认为双酶切按理说不应该自连这么严重啊~ 会不会是双切的时候，有一个酶没切开？但是Bgl II和Xhol I都是常用酶，还共用H-buffer，这样看来会不会是其中一个酶失活了？ 带着这个猜测，我用两种酶分别单切了质粒，再加上一个未切的质粒作control，跑出来的结果是：两个酶都在4800bp处有条带，而control由于超螺旋明显跑到了前面。。。但我留意到其中Xhol I 在大于5K marker的地方，也就是更靠后的地方还有一条带，俺的问题就在这里：这是不是说吗Xhol I 有问题？是不是一部分只切开了单链？ 另外如果不是酶的问题，这个过程中还会有哪些步骤会导致“克隆很多，却全是空载体”这种局面呢？ 跪求指导~ |
回复此楼» 猜你喜欢
解密度鲁特韦——新一代HIV整合酶抑制剂的化学、药理与产业化图景
已经有0人回复
-
左炔诺孕酮从沃氏氧化物到炔基化反应的工艺迭代与靶点解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有120人回复
-
“关闭瘙痒信号”的多肽地非法林醋酸盐全解析
已经有1人回复
-
Tosylate-DPA-714介导¹⁸F-DPA-714 PET成像的前沿进展
已经有0人回复
-
I-BRD9: BRD9溴结构域化学探针，BET选择性>700倍
已经有0人回复
-
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
xiaofei1712
铁虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 772.1
- 散金: 2
- 红花: 1
- 帖子: 179
- 在线: 101.4小时
- 虫号: 1776413
- 注册: 2012-04-24
- 专业: 生物技术药物
2楼2014-09-04 17:44:38
3楼2016-10-07 22:31:41